Челюсти геккона: Прохладный прием — обзор DLC Челюсти Гаккона — Dragon Age: Inquisition — Игры

Содержание

Прохладный прием — обзор DLC Челюсти Гаккона — Dragon Age: Inquisition — Игры — Gamer.ru: социальная сеть для геймеров

Прохладный прием — обзор DLC Челюсти Гаккона

Жози, я скучала!

Известно, что Dragon Age: Inquisition не так уж и похожа на Origins, и вообще пошла по стопам второй части. В хорошем смысле этого слова: плавно и весьма логично Инквизиция перешла к новой истории, оставив место любимым персонажам. Повествование переросло пыльные улочки Кирквола, развернулось по всему Тедасу, расцвело тропическими джунглями, пустынными закатами и промозглыми болотами. У разработчиков были силы, время и желание воссоздать огромный прекрасный мир. Пустить игрока в горы и под землю, показать величественные памятники Тевинтера и стершиеся эльфийские письмена — дать то, на что в Origins не было ресурсов. Да-да, не зря Инквизитор бродит по Ферелдену и даже спускается на глубинные тропы. Мы можем, наконец, взглянуть на мир не с высоты тактической камеры, а глазами местного жителя.

И он весьма хорош с такого ракурса.

Однако где-то по пути Origins пропала. Припорошенная пылью уютная мрачная сказка сменилась эпической сагой, полной надежды и приключений. Самое странное, что формально все осталось прежним. Мир обречен и лишь вы можете его спасти. Вам предстоит шаг за шагом завоевать репутацию, собрать вокруг себя людей и дать решительный отпор абсолютному злу. Но одновременно все иначе.

Кто-то скажет, что пропала душа – возможно, но тогда ей на смену пришла новая. Вместо отчаянного героя Ферелдена с горсткой спутников к нам явился полный изящной уверенности Инквизитор во главе церковного ордена. Он ведет людей к свету и вовсе не собирается погибнуть в финальном бою. О, эта насмешка над сломленным противником: ты же хотел в Тень?

Прохладный прием — обзор DLC Челюсти Гаккона

Снимала бы и снимала местные пейзажи, но устала отключать интерфейс каждый раз

Его глазами Тедас видится совсем иным. Этот новый мир трудно соотнести с теми легендами, который мы по крупицам собирали раньше. Эхо жизни Андрасте, истории о Серых Стражах, смутные слухи о Тевинтере… но мы же сейчас совсем о другом! Известная история мира не отражается на текущих событиях, азы приходится рассказывать заново. И возникает ощущение недосказанности, действие виснет в воздухе, не имея корней.

Мы многое узнаем в ходе игры, но явно недостаточно. Вопросов после последнего боя остается больше, чем было до. И DLC “Челюсти Гаккона” создано исправить эту ситуацию. Нет, в нем не расскажут, что же произошло после. Слово «сюжетное» говорит лишь о том, что это законченная отдельная история, а не набор доспехов или новый кооперативный режим. Зато оно освещает неизвестные нам раньше поворотные моменты прошлого.

Прохладный прием — обзор DLC Челюсти Гаккона

Прямо вот беру факел и освещаю…

После активации и установки добрых двух гигабайт дополнения в Скайхолде обнаруживаются небольшие изменения.

В подвале у Дагны появляется хранилище, куда можно сбросить лишнее, но дорогое сердцу барахло. Там же появился стол для покраски доспехов — за единицу ресурса нужного цвета можно перекрасить плащик в розовый. А на столе военного совета доступна новая локация. Открыть ее обойдется вам в восемь единиц влияния. Осторожней! Покорить Морозную котловину сумеет лишь сильный духом. Привычный набор агрессивной фауны рассчитан на высокоуровневого персонажа. Жители разрыва на три-четыре уровня выше, не смущаясь, втаптывали в грязь мою самонадеянную команду, а четверку демонов отчаянья тридцатого уровня я и вовсе оставила чахнуть над их проклятым золотом. Целее буду.

Территория дополнения сопоставима с Штормовым берегом, но гораздо разнообразнее. Во-первых, стремительная высокогорная смена климата — в низинах настоящие джунгли с тропическими птицами, а выше уже один мох. Зловещие болота и бодрые водопады тоже в комплекте. Во-вторых, в ходе выполнения основной сюжетной линии мы сможем побывать в Котловине как днем, так и ночью. И, главное, никакого дождя.

Прохладный прием — обзор DLC Челюсти Гаккона

А звезд-то не видно

Если вам не хватает исследований в основной кампании, то тут все для вашего удовольствия. Три астрариума (один из которых у меня не заработал), три окуляриума с двенадцатью осколками, неочевидные ориентиры, мощные разрывы и тевинтерские руины. Награда за покорение котловины весьма щедрая — я обновила гардероб фиолетовым оружием, а ведь пришла уже после победы в основной части. Впрочем, посоха мечты для леди Инквизитор не нашлось, поэтому гораздо больше меня порадовали аваррские торговцы. Заманчивые эскизы четвертого уровня и третий в игре торговец с бесконечным запасом простеньких лечебных трав, очень удобно. Вкусные материалы для рун можно выковырять из демонических останков, а с тел местных жителей можно снять ткань, защищающую от холода. Вообще после полного покорения Котловины мороз вас больше не побеспокоит — собранные осколки можно тут же и потратить на открытие волшебной ледяной комнатки, аналогичной храму в Оазисе, и серьезно повысить свою устойчивость к стихии.

Прохладный прием — обзор DLC Челюсти Гаккона

Типичная авварская статуя. Идеальна чтобы привести Дориана в уныние

Основная линейка заданий состоит из двух частей — археологической и этнографической. Инквизитор отправляется на поиски информации о коллеге, легендарном Америдане, сгинувшем в этих краях восемь сотен лет назад. Вам предстоит отбить экспедицию у агрессивных рептилий, пообщаться с местными духами, разгадать древнюю загадку и проследить путь последнего (до вас, конечно) Инквизитора. Готовьтесь к неожиданным историческим открытиям и личной драме давно почивших героев.

Этнографическая часть начинается, когда вы понимаете что без помощи местных жителей вам со своей миссией не справиться. Придется освоиться с авварскими традициями, защищать интересы племени и, наконец, заслужить статус почетного сородича. А за сородичем аввары встанут огнем и мечом.

И обе квестовые ветки объединятся в красивом финальном задании с небольшим лабиринтом, кровопролитными боями и древним ледяным драконом.

Прохладный прием — обзор DLC Челюсти Гаккона

Похоже, моему магу в скромной легкой броне сейчас придет конец

«Челюсти Гаккона» — дополнение как оно есть. По сути это просто еще одна игровая локация, качественная и красочная, но ничем принципиально от старых не отличающаяся. Никаких новых персонажей, никакой романтики и никаких срывов покровов. Новые предметы и даже новое заклинание для Инквизитора вряд ли вам понадобятся, если вы уже прошли игру. Но с точки зрения истории мира DLC очень любопытно: после знакомства с подробностями жизни последнего Инквизитора на прошлое Тедаса смотришь под иным углом.

Прохладный прием — обзор DLC Челюсти Гаккона

Даже одного мага хватит для знатного фейерверка, а у меня их два

Брать стоит исключительно ради удовольствия еще на 5-10 часов погрузится в Inquisition, победить демонов, забороть нового дракона и раскрыть тайны прошлого. Для тех, кто просто следит за серией или невзлюбил последнюю часть, тут мало интересного, проще потом пересказ прочесть.

Драгон эйдж инквизиция челюсти геккона как начать

Во первых, вам необходимо купить дополнение Jaws of Hakkon. Оно стоит около $15 (без учета региональных цен). После этого, вам необходимо скачать его – вес составляет около 1.5 Гб. Также рекомендуется иметь по крайней мере 20-й уровень.

Когда DLC установлен, запускайте игру, после чего вы получите сообщение об активных квестах в новой области Frostback Basin.
Доберитесь до стола в Скайхолде и оттуда отправляйтесь в Ферелден. Тут появится новый маркер миссии на карте: исследуйте Frostback Basin.

Для выполнения вам потребуется 8 Власти, при этом детали указывают, что вы должны помочь Орлеанскому профессору, который хочет работать с Инквизицией для открытия древних реликвий способных помочь кампании.

Миссия выполняется сразу. После этого вы попадаете в новую зону и видите кат-сцену, где вам дают квест по расследованию судьбы прошлого Инквизитора, который жил около 800 лет назад.

Новая зона имеет минимум 20 уровень, так что тут не будет легкой прогулки.

Авторский блог об играх для ПК и консолей от Sony, Microsoft, Nintendo. Обзоры, новости, гайды, аналитика.

Обзор DLC Челюсти Гаккона для Dragon Age Inquisition

Покупать загружаемые дополнения для игр от Electronic Arts и BioWare не рекомендую никому. Слишком уж затратный процесс, не окупающийся исходя из объёмов доступного контента. С другой стороны, спустя год-два выходят полные издания, где искомые DLC присутствуют изначально.

К сожалению, в случае с трилогией Mass Effect этого не произошло до сих пор. Не будем о грустном, а лучше представим обзор Челюсти Гаккона, повествующий о судьбе Инквизитора, пропавшего почти 800 лет назад. Ранее уже рассматривали аддон «Нисхождение».

Первое, что бросается в глаза при изучении новой локации – это резкие перепады биомов: равнины, туманные низины, гористые местности и заснеженные холмы. Красота местных пейзажей завораживает, очаровывает и заставляет регулярно снимать скриншоты.

Посещение Морозной Котловины превращается в увлекательное географическое путешествие, в котором встретятся не только новые враги, но и парочка интересных квестов, разбавленных привычным для Dragon Age Inquisition гриндом с уничтожением всех попадающихся мобов. Рекомендуемый уровень персонажа – от 20 и выше.

Обзор Челюсти Гаккона – тайные истории мира

Именно своим лором данное дополнение и подкупает, не предлагая ничего принципиально нового. Дополнительные возможности в виде заклинаний и предметов служат скорее бонусом и довеском, чем важной геймплейной составляющей. Прохождение займёт до десяти часов лишь в случае, если кому-то взбредёт в голову искать все осколки через окуляры, собирать материалы, выполнять побочные задания и добывать рецепты.

Основные квесты интересные, включают пару примитивных головоломок и даже сюжетную драму в финале. Будет здесь и битва с драконом, о которой упомянем ниже. Из недостатков отмечу лишь этап, где нам предстоит вновь перемещаться по всей карте, активируя путеводные метки – весело до невозможности…

Чувствуется, что студия BioWare всеми силами стремилась увеличить продолжительность DLC, но обвинений в завышенном ценнике всё-таки не избежала. При всех минусах дополнения и игры Dragon Age Inquisition она всё ещё на голову выше, чем недоразумение под названием Mass Effect Andromeda, где основным видом деятельности вне боя было сканирование.

Гаккон Зимодых: как убить?

Сложности могут возникнуть в битве с драконом, который атакует с воздуха, изрыгает из пасти ледяные шары и (внезапно) очень уязвим к огню. Простейший способ состоит в поиске места на локации, указанного на скриншоте. Достаточно засесть там лучником, дабы все атаки Зимодыха проходили мимо.

Шар до вас попросту не долетит, а притягивание с отнятием небольшого процента HP легко компенсируется за счёт лечебных зелий, коих к тому моменту уже должно быть 12. Дополняйте выстрелы из лука ядовитыми стрелами, огненными заклинаниями и любыми другими дистанционными атаками, на управление остальными бойцами отряда можете вообще не отвлекаться. Метод не самый быстрый, но эффективный.

Известно, что Dragon Age: Inquisition не так уж и похожа на Origins, и вообще пошла по стопам второй части. В хорошем смысле этого слова: плавно и весьма логично Инквизиция перешла к новой истории, оставив место любимым персонажам. Повествование переросло пыльные улочки Кирквола, развернулось по всему Тедасу, расцвело тропическими джунглями, пустынными закатами и промозглыми болотами. У разработчиков были силы, время и желание воссоздать огромный прекрасный мир. Пустить игрока в горы и под землю, показать величественные памятники Тевинтера и стершиеся эльфийские письмена – дать то, на что в Origins не было ресурсов. Да-да, не зря Инквизитор бродит по Ферелдену и даже спускается на глубинные тропы. Мы можем, наконец, взглянуть на мир не с высоты тактической камеры, а глазами местного жителя. И он весьма хорош с такого ракурса.

Снимала бы и снимала местные пейзажи, но устала отключать интерфейс каждый раз

Его глазами Тедас видится совсем иным. Этот новый мир трудно соотнести с теми легендами, который мы по крупицам собирали раньше. Эхо жизни Андрасте, истории о Серых Стражах, смутные слухи о Тевинтере. но мы же сейчас совсем о другом! Известная история мира не отражается на текущих событиях, азы приходится рассказывать заново. И возникает ощущение недосказанности, действие виснет в воздухе, не имея корней.

Прямо вот беру факел и освещаю.

В подвале у Дагны появляется хранилище, куда можно сбросить лишнее, но дорогое сердцу барахло. Там же появился стол для покраски доспехов – за единицу ресурса нужного цвета можно перекрасить плащик в розовый. А на столе военного совета доступна новая локация. Открыть ее обойдется вам в восемь единиц влияния. Осторожней! Покорить Морозную котловину сумеет лишь сильный духом. Привычный набор агрессивной фауны рассчитан на высокоуровневого персонажа. Жители разрыва на три-четыре уровня выше, не смущаясь, втаптывали в грязь мою самонадеянную команду, а четверку демонов отчаянья тридцатого уровня я и вовсе оставила чахнуть над их проклятым золотом. Целее буду.

Территория дополнения сопоставима с Штормовым берегом, но гораздо разнообразнее. Во-первых, стремительная высокогорная смена климата – в низинах настоящие джунгли с тропическими птицами, а выше уже один мох. Зловещие болота и бодрые водопады тоже в комплекте. Во-вторых, в ходе выполнения основной сюжетной линии мы сможем побывать в Котловине как днем, так и ночью. И, главное, никакого дождя.

А звезд-то не видно

Если вам не хватает исследований в основной кампании, то тут все для вашего удовольствия. Три астрариума (один из которых у меня не заработал), три окуляриума с двенадцатью осколками, неочевидные ориентиры, мощные разрывы и тевинтерские руины. Награда за покорение котловины весьма щедрая – я обновила гардероб фиолетовым оружием, а ведь пришла уже после победы в основной части. Впрочем, посоха мечты для леди Инквизитор не нашлось, поэтому гораздо больше меня порадовали аваррские торговцы. Заманчивые эскизы четвертого уровня и третий в игре торговец с бесконечным запасом простеньких лечебных трав, очень удобно. Вкусные материалы для рун можно выковырять из демонических останков, а с тел местных жителей можно снять ткань, защищающую от холода. Вообще после полного покорения Котловины мороз вас больше не побеспокоит – собранные осколки можно тут же и потратить на открытие волшебной ледяной комнатки, аналогичной храму в Оазисе, и серьезно повысить свою устойчивость к стихии.

Типичная авварская статуя. Идеальна чтобы привести Дориана в уныние

Основная линейка заданий состоит из двух частей – археологической и этнографической. Инквизитор отправляется на поиски информации о коллеге, легендарном Америдане, сгинувшем в этих краях восемь сотен лет назад. Вам предстоит отбить экспедицию у агрессивных рептилий, пообщаться с местными духами, разгадать древнюю загадку и проследить путь последнего (до вас, конечно) Инквизитора. Готовьтесь к неожиданным историческим открытиям и личной драме давно почивших героев.

Похоже, моему магу в скромной легкой броне сейчас придет конец

«Челюсти Гаккона» – дополнение как оно есть. По сути это просто еще одна игровая локация, качественная и красочная, но ничем принципиально от старых не отличающаяся. Никаких новых персонажей, никакой романтики и никаких срывов покровов. Новые предметы и даже новое заклинание для Инквизитора вряд ли вам понадобятся, если вы уже прошли игру. Но с точки зрения истории мира DLC очень любопытно: после знакомства с подробностями жизни последнего Инквизитора на прошлое Тедаса смотришь под иным углом.

Даже одного мага хватит для знатного фейерверка, а у меня их два

Dragon Age: Inquisition (+ все DLC) | DarkFess

А на этой странице мы поговорим обо всех DLC игры. Обычно о дополнениях я отдельно не пишу, но тут это отдельный случай. У игры вышло 3 DLC, два из разряда обычных, и одно сюжетное.. а именно, это полноценный эпилог игры, продаваемый отдельно. Как вам такое нравится?) Представьте себе, что вы покупаете книгу.. а эпилог к ней продается отдельно, например, в журнале. Но именно так нынче дела обстоят в современном игропроме. Поговорим о каждом из них.

>>> страница 1 (основная игра)

Челюсти Гаккона

Это первое DLC. Новая локация, называющаяся Морозная котловина (кстати, странно что так, потому что там почти нет снега. Тем не менее история идет об племенах Авааров. Добрые племена нам помогают, а злые хотят найти и пробудить своего запечатанного в виде дракона древнего бога – Гаккона. Мы исследуем новую локацию, собираем осколки, выполняем квесты. Потом, по сюжету, мы узнаем историю первого Инквизитора – Америдана, который не смог убить Гаккона и запечатал его во времени. Тут появляемся мы, всех убиваем… конец. DLC очень даже в стиле Dragon Age, новая локация, драконы, разломы. В целом прикольно, но воспринимать ее стоит не более, чем дополнительный контент и новая открытая локация со своей историей. Этой DLC, в целом, я поставлю 4.

Нисхождение

Второе DLC. Интереснейшее приключение в самую гущу Глубинных Троп. И все же, здесь становится ясно, что туннели и кишкообразные локации у BW получаются лучше всего. Все это напоминает старый добрый Dragon Age: Origins. Лазить там очень интересно и прикольно. Сначала стандартные гномьи руины.. очень обширные, постоянные замесы с Порождениями Тьмы. Потом спуск все ниже и ниже. Наконец неведомые враги из темноты, древнее племя гномов с крутым оружием. Заброшенная лириумная шахта (очень интересно было ее увидеть, оказывается лириум это нечто органическое, а я всегда думал что это что-то типа руды). Подземное море) Все это просто завораживает. Дальше – больше. Титан, сердце титана, целый подземный мир с деревьями, птичками и т.д. В общем мне данное DLC очень понравилось. Такая себе независимая адвентура. С помощью Инквизиции, потом можно достроить разрушенные мосты и поизучать все спрятанные секреты.. ня! В общем, годная тема! Ставлю ей 5.

Чужак

DLC из разряда Must Have! Полноценный эпилог игры, плавно перетекающий в пролог следующего Dragon Age. И, что самое главное, наконец то достойная концовка от Bioware. Самое главное – созван Священный Совет, и мы должны решить судьбу Инквизиции. Попутно наш ГГ отражает планы кунари во вторжению в Тедас и Орлей. А еще, по поводу основной задумки нас кормили крошками на протяжении всей игры. А тут, ВНЕЗАПНО, идет полный срыв покровов.. без тормозов.

Намек, который дали в конце основной игры про Соласа. здесь полностью раскрыт. Он древний бог – “Ужасный волк”, и здесь, по сути, описывается полностью вся история эльфов, завесы и создания всего современного мира.Там довольно долгая история, не буду пересказывать. Ну, короче говоря, суть в том, что Солас оказался главным злодеем – который всегда хотел разрушить Завесу полностью (т.е. по сути уничтожить мир, если учесть сколько проблем создала одна только Брешь). Правда без сферы и якоря, у него на это уйдет больше времени… сфера уничтожена вместе с Корифеем. из-за этого Солас так и расстроился тогда. А якорь всегда был в нас, у Инквизитора. Однако он не предназначен для тела обычного смертного, и мы им всегда пользовались, по сути, только благодаря Соласу (он его стабилизировал). Теперь же якорь вышел из-под контроля и становится все сильнее, тем самым убивая Инквизитора. После последней беседы с Соласом, он отсекает руку Инквизитору и уходит в Элювиан (непонятно, с якорем или без.. и кстати, теперь он контролирует и сеть всех телепортов). Действо сопровождается прекрасным саундтреком и полным срывом покровов, особенно про историю эльфов. Все что мы можем от Соласа получить будучи эльфом, это только уникальные диалоги (особенно драматичные в случае эльфийки и ее романа с лысым).

Итого: Солас становится врагом №1, Инквизитор решает преобразить Инквизицию в миротворческий корпус и подчинить ее Верховной Жрице (Лелиане). В финальном ролике, руководство Инквизиции планирует дальнейшие действия в Империи Тевинтер. Очевидно, что в следующей части игры, нас будет ожидать новый ГГ… а калека Инквизитор встретится нам, максимум, как NPC. Также, нас ждет полноценная финальная заставка, с полным объяснением последствий наших решений и судеб всех главных персонажей.

Удивительно но факт, впервые на моей памяти, столь важные сюжетные повороты вынесены в DLC. Но лучше уж так, чем то, как они поступили с Mass Effect 3, ИМХО. Оценка для DLC: 5+

Итого, DLC отлично дополняют DA: Inq. Интересно, насколько долго BW смогут еще тянуть индивидуальную историю вселенной DA со всеми принятыми игроками индивидуальными решениями во всех частях серии))

dragon age inquisition способности инквизитора

Быстрая эгида . Вы манипулируете завесой так ловко, что создаёте Эгиду разрыва быстрее обычного.

Время восстановления: 60 с

(требуется наличие DLC «Челюсти Гаккона»)

В зависимости от выбранного класса вам будут доступны различные виды способностей, по 4 группы на каждый класс.

Примерно в районе 10-го уровня (зависит от того, на сколько быстро вы будете проходить основную сюжетную линию) вам станет доступна одна из специализаций, которая откроет вам доступ к новым, мощным навыкам. Спутники получают свои специализации автоматически, как только вы открываете локацию Скайхолд.

Способности Воинов

Оружие и щит
Воины, использующие одноручное оружие и щит, и соответствующие способности для этого типа экипировки способны оставаться на ногах даже после таких ударов, которые бы сразили на повал кого-либо из их спутников. Особо опытные бойцы способны использовать щит не только как средство обороны, но и как оружие, которым можно ошеломить врага.

Двуручное оружие
Мастера двуручного оружия наносят врагам сокрушительные удары, способные пробить любую защиту, смять любой доспех и уничтожить любого противника.

Мастер боя
Воины с развитым мастерством боя держат под контролем все поле сражения. Они укрепляют союзников, мешают действовать врагам и пользуются любым слабым местом, которое найдут.

Авангард
Никто так хорошо не защищает всю группу, как воин с развитыми способностями авангарда. Он не только хорошо держит удары, но и провоцирует все врагов атаковать себя, позволяя остальным союзникам наносить контрудары.

Способности Разбойников

Парные кинжалы
Мастера этого стиля быстры и смертоносны. Своими клинками они способны пробить любую вражескую защиту и перерезать любому глотку, не дав врагу времени среагировать.

Стрельба
Мастера этого стиля предпочитают дальний бой. Они умеют не подпускать к себе врагов, пронзать одной стрелой нескольких противников и даже стрелять бомбами, поражая целую область.

Вредительство
Это эксперты по части ядов и ловушек. После их грязных приемов враги слабеют и хромают, становясь легкой мишенью для острого кинжала и шипастой стрелы.

Уловка
Эти умельцы мастера морочить голову и заметать следы. Они вечно не там, где их ожидают увидеть: то перепрыгнут в укромный уголок за секунду, то растворятся в сумраке, то враг, замахнувшись, попадет по пустому месту…

Способности Магов

Дух
Мастера этой школы магии призывают для защиты духов и саму сущность Тени. Их заклинания разрушают враждебную магию, создавая защитные барьеры, и даже залечивают раны.

Зима
Мастера этой школы магии призывают холод, перед которым блекнут самые суровые зимы. Эти ледяные заклинания замедляют и ослабляют врагов.

Преисподняя
Мастерам этой школы магии одержать победу на поле боя помогает необузданный огонь. Враги, выжившие при первом взрыве, сходят с ума от ужаса или сгорают заживо в языках негаснущего пламени.

Буря
Мастера этой школы магии призывают себе на помощь гром и молнию. Их заклинания парализуют врагов и перекидываются с одного врага на другого.

Перки в Dragon Age: Inquisition появляются по мере развития Инквизиции и усиления её влияния. Получить это влияние можно за так называемым «Столом войны», проходя различные задания, побеждая врагов, выполняя миссии и т. д. Каждый раз, когда уровень влияния заполняется до предела, вы можете повышать свой уровень и, соответственно, получать новые перки.

Перки Инквизиции делятся на четыре типа. Три из них даруются тремя советниками, а четвертый — самой Инквизицией. Силы, даруемые Калленом, позволяют развить силу и выносливость. Секреты Лилианы прорабатывают скрытные черты и навыки персонажей. Перки общения Джосефины помогут в дипломатии и убеждении. И, наконец, перки самой Инквизиции развивают общие способности.

Обратите внимание!

Получение перков в Dragon Age: Inquisition — процесс не столь быстрый, чтобы бездумно вкладываться в те перки, которые вам не будут нужны. Некоторые перки доступны с самого начала игры и требуют вложения в них очков опыта.

Некоторые продвинутые перки становятся доступны только после разблокирования более низкоуровневых перков. Перки, рекомендуемые в первую очередь, выделены жирным шрифтом.

We use cookies on our website to give you the most relevant experience by remembering your preferences and repeat visits. By clicking “Accept”, you consent to the use of ALL the cookies.

Manage consent

«Геккон двигает своей верхней челюстью»

Таким образом, заменой одной рептилии на другую — геккона на крокодила — хорошо запомнившееся зоологическое утверждение в греческой прозе Арнольда, наконец, получило удовлетворительное основание. Весной 1886 года я поймал маленького геккона ( Tarantola mauritanica ) в Риме, и до сих пор мне удавалось сохранить его живым и здоровым. Одна из первых вещей, которые я заметил в нем, была необычайная сила, с которой такое маленькое животное кусало за палец.И произведенный эффект, безусловно, был связан скорее с выражением сильной свирепости ящерицы во время процесса, чем с уколом, который она могла дать. Выражение лица в основном зависит от двух вещей: от того факта, что передняя часть головы может быть наклонена вниз, и от того, что глаза втянуты в голову. При более внимательном рассмотрении первого движения было замечено, что при открывании рта верхняя челюсть отчетливо, хотя и немного приподнята над нормалью, так что профиль верхней поверхности головы становится почти прямым (ср. Рис.1 и 2). При сильном укусе верхняя челюсть обычно опускается ниже нормы, как это хорошо видно на виде профиля (сравните рис. 3), хотя в других положениях кривизна головы нормальная, а в других — профиль. может оставаться прямым при клеве (как на рис. 2). Насколько я мог наблюдать у Тарантолы, верхняя челюсть всегда поднималась при открывании рта, а профиль головы выпрямлялся по сравнению с нормальным изгибом в состоянии покоя, но при закрывании рта при кусании движение верхней челюсти зависело от относительное положение животного по отношению к объекту, который оно кусало.Это углубление верхней челюсти также часто можно наблюдать, когда рот закрыт, и это может быть вызвано легким давлением на голову. Кажется, что животное максимально использует свои способности выражения, поскольку при провокации оно с величайшей готовностью открывает свою относительно большую пасть и будет держать ее открытой в течение значительного времени, в течение которого его внешний вид достаточно внушает благоговение. Тот факт, что передняя часть черепа не срастается с задней, хорошо известен.Так, в «Анатомии позвоночных» Хаксли (1871, стр. 225) в отношении гекконов делается следующее утверждение: «Ни верхние, ни нижние височные дуги не окостенели, постфронтальная часть связана с чешуйчатой костью, а верхняя челюсть — с верхнечелюстной костью. квадратная связка; и г-н Буленджер сообщает мне, что если бы его спросили, двигается ли верхняя челюсть таких ящериц при кусании, он был бы склонен ответить утвердительно, исходя из хорошо известного состояния черепа. Но я полагаю, что до сих пор фактически не наблюдалось, что такие подвижные сочленения обладают функциональной ценностью у живого животного и что гекконы должны быть добавлены к хорошо известному примеру попугаев, как Vertebrata, которые двигают верхней челюстью при кусании.Весьма вероятно, что те же наблюдения будут справедливы и для других семейств ящериц.

Как зубы геккона приспособлены к тому, что он ест?

Автор: Иветт Саджем

i Jupiterimages / Photos.com / Getty Images

Гекконы — красочные, ловкие маленькие ящерицы, относящиеся к семейству рептилий Gekkonidae. Существует более 2000 видов, населяющих различные среды обитания на всех континентах, кроме Антарктиды. Гекконы плотоядны, то есть основная часть их рациона состоит из мяса других животных.Их зубы приспособлены к их особому способу питания, а также к охоте и самообороне.

Строение зуба и челюсти

У большинства гекконов есть ряды маленьких конических зубов, выстилающих предчелюстную и верхнечелюстную кости на верхней челюсти и зубную кость на нижней челюсти. В зависимости от вида на предчелюстной кости имеется от 9 до 13 зубов; количество зубов на других костях варьируется из-за многократной потери и повторного роста зубов. На верхней челюсти обычно больше зубов, чем на нижней.Всего у гекконов от 50 до 100 зубов, за исключением. По неизвестным причинам у листохвостого геккона более 300 зубов, что, скорее всего, является наибольшим количеством зубов среди наземных позвоночных.

Замена зубов

Гекконы рождаются с полностью сформированными обнаженными зубами, которые постоянно теряются и восстанавливаются каждые несколько месяцев на протяжении всей своей жизни. Замещающие зубы развиваются автоматически. Они растут под поверхностью челюсти, пока не протолкнут ткани и не вытеснят существующие зубы, гарантируя, что у гекконов всегда есть неповрежденные зубы.Поскольку гекконы полностью зависят от полностью функциональных зубов в плане потребления и защиты добычи, регенерация зубов является жизненно важным элементом их выживания.

Время обеда

Несмотря на большое количество зубов, гекконы не пережевывают пищу. Как и другие рептилии, они глотают пищу целиком. Поскольку они не жуют, их зубы не выровнены точно, чтобы их можно было разрезать, разрезать и измельчить. Скорее их зубы используются, чтобы схватить, сокрушить и убить жертву насекомых. С помощью языка, мускулов челюсти и движений головы они заставляют насекомых сесть в глотку.

Многофункциональные рты

Они не могут использовать их для жевания, но гекконы используют свои зубы для других целей. Самозащита — необходимый навык для маленьких уязвимых рептилий. Обычно они миролюбивы по своей природе, но если их спровоцировать или запугать, гекконы кусают людей, хищников и друг друга. Особенно склонны к ожесточенным дракам за территорию самцы и самки. Они также используют свои зубы во время процесса линьки. Гекконы сбрасывают кожу несколько раз в год. Они используют зубы, чтобы стянуть старую кожу со своего тела, обычно потребляя ее, поскольку она полна полезных питательных веществ.

Ссылки

Ресурсы

Фотоальбом

Биография писателя

Иветт Саджем является профессиональным писателем с 1995 года. Ее работа включает поздравительные открытки и две детские книги. Пожизненная защитница животных, она активно занимается спасением и транспортировкой животных, и особенно неравнодушна к пожилым животным и животным с особыми потребностями.

МБД — дефицит кальция — Supreme Gecko

(* Примечание редактора. Следующее электронное письмо было отправлено другим хранителем гекконов, у которого возникла серьезная проблема с этим гекконом.Челюсть вообще не закрывалась. Мы переписывались друг с другом по электронной почте несколько раз, и в результате Кен придумал это быстрое объяснение проблемы и шагов, которые он предпринял.)

Сначала попросите ветеринара осмотреть геккона, чтобы убедиться, что у него не сломана челюсть, чтобы вы не участвовали в невозможной битве. Если челюсть сломана, велика вероятность, что она не заживет должным образом даже с челюстной шиной.
Обратите внимание, что дефицит кальция необходимо лечить как можно скорее, чтобы обеспечить наилучшие шансы на выздоровление и выживание гекконов.Геккон умрет очень болезненной смертью от дефицита кальция, если его не лечить.

(Дополнительное лечение) Обеспечьте геккону лампой UVB не менее 8 часов (в светлое время суток), чтобы помочь геккону усваивать кальций. (Примечание редактора — это очень рискованно и должно выполняться с большой осторожностью!)

Рассматривайте как нормальный дефицит кальция следующим образом:
Попросите ветеринара сделать геккону инъекцию кальция. Затем обработайте его известковой жидкостью в соответствии с предписаниями ветеринара. Первая неделя 0,08 куб. См кальциевой жидкости два раза в день.0,01 см3 пероральной суспензии метакама через день в течение двух недель. Включите следующее лечение одновременно — 0,5 мл диеты хохлатого геккона. 5 мл воды давайте геккону ежедневно шприцем в течение двух недель.

Вторая неделя 0,08 мл кальциевой жидкости один раз в день .

Если после второй недели состояние сохраняется: 0,08 куб. См кальцинированной жидкости через день. Через две недели позвольте геккону есть и пить из посуды. Кормите каждый день в течение одной недели, а затем через день. Геккон может все еще быть немного слабым после первых двух недель.Лучше всего держать геккона и позволить ему есть и пить из небольшой миски самостоятельно. Отслеживайте и измеряйте, сколько геккон ест и пьет. Должно быть не менее 0,5 мл каждой воды и Created Gecko Diet Быстро окуните его морду в воду, чтобы побудить к еде и питью. Еда и питье должны занимать не более 30 минут. После этого верните геккона и дайте ему отдохнуть.

После третьей недели начинает побуждать геккона идти, если это еще не началось. Осторожно поднесите его к месту соединения хвоста и тела.Геккон сделает пару шагов. Сделайте это всего несколько раз, так как геккон быстро утомится. Продолжайте это делать каждый день в течение одной недели, а затем через день через четыре недели. Геккон медленно восстанавливает силы.

Обратите внимание, я не ветеринар. Самый частый признак дефицита кальция — тектонические подергивания пальцев ног. Зияющая челюсть появляется только в тяжелых случаях дефицита кальция и может не давать никаких предварительных показаний. Я прочитал несколько книг и листов по уходу за хохлатым гекконом и ничего не увидел об этом состоянии.Единственное место, где я видел это, было сообщение на форуме Repashy.

Лечу гекконов с 23.08.07 почти две месяца вышеупомянутого лечения. Состояние геккона не вылечило полностью, но оно улучшилось.

— Кен Карлайл

Токайский геккон | Смитсоновский национальный зоопарк

Токайские гекконы имеют толстые цилиндрические тела с головами, отделенными от шеи. Их конечности хорошо очерчены и мощны, а тело покрыто пятнами.

Существуют два варианта токайских гекконов: красно-пятнистый и черно-пятнистый. У токайского геккона с красными пятнами эти пятна варьируются от светло-желтого до красного и покрывают голубоватое или сероватое тело. Их окраска важна для маскировки, и они могут фактически осветлять или затемнять цвет своей кожи, чтобы лучше гармонировать с окружающей средой.

Складки кожи не дают этим гекконам отбрасывать тень, когда они отдыхают на дереве. Складки полностью раскрываются, стирая грань между телом и деревом.

Токайский геккон может при обороне отбрасывать свой хвост, ломая его на нескольких участках. Отброшенная часть хвоста продолжает яростно двигаться в течение нескольких минут, давая геккону время сбежать. Хвост геккона регенерируется примерно за три недели, хотя обычно он вырастает не так долго, как оригинал.

Geckos известны своим невероятным захватом и способностью «прилипать» к поверхностям. Сила захвата токайского геккона особенно впечатляет и может выдержать около 450 фунтов.Они прикрепляются к вертикальным и нависающим поверхностям с помощью щетинок, тонких нитей, которые создают большую площадь поверхности и образуют молекулярные связи. Ящерицы могут держаться за вертикальную поверхность одним пальцем за раз

Они также молниеносны и имеют очень сильный укус, из-за которого может пролиться кровь. При укусе токайского геккона, как и других рептилий, лучше не тянуть и не тянуть; это заставит животное усилить хватку. Вместо этого поместите все четыре конечности на ровную поверхность рядом с потенциальным «отступлением» и подождите, пока животное отпустит.

У токайского геккона есть видимые отверстия для ушей с обеих сторон головы. В нем есть остатки маленького рудиментарного «третьего глаза», известного как средний глаз или теменный глаз, который связан с шишковидной железой. Эта особенность отсутствует у других гекконов, но встречается у дневных видов двух отрядов рептилий Squamata и Rynchocephelia. Он не делает снимков, но очень чувствителен к свету, что заставляет ученых полагать, что он помогает регулировать активность в различных условиях освещения.

Два других глаза геккона большие, выпуклые, с вертикально-разрезанными зрачками коричневатого цвета. Веки этих двух глаз сросшиеся и прозрачные.

Он дышит носом и нюхает. Большое количество сенсорных клеток на мембране ноздрей помогает геккону улавливать запахи. Они также используют свой язык для переноса частиц запаха к органу Якобсона (участку сенсорных клеток), чтобы «попробовать» воздух.

границ | Удаление зубов у леопардового геккона и образование замещающих зубов de novo

Введение

Полифиодонтия, или пожизненная замена зубов, — это процесс развития, характерный для большинства позвоночных, не являющихся млекопитающими.У полифиодонтовых рептилий хорошо задокументировано, что замещение происходит волнами, которые проходят от задней части рта к передней в чередующемся положении зубов (Edmund, 1960, 1962; Cooper, 1966; Kline and Cullum, 1984; Kline and Cullum, 1985; Fastnacht, 2008; Grieco, Richman, 2018; Hanai and Tsuihiji, 2019). Одним из ключевых компонентов выражения этих волн замещения на уровне челюстей является то, что положение каждого зуба циклически изменяется по временно отложенному графику из соседних положений. Исследование замены зубов у молодых леопардовых гекконов показало, что формирование паттерна начинается в ovo и непрерывно у животных после вылупления, что указывает на некоторые консервативные механизмы на уровне паттерна у взрослых (Grieco and Richman, 2018).Однако механизмы, лежащие в основе этой циклической замены зубов, все еще недостаточно изучены.

Во многих исследованиях изучались потенциальные механизмы установления этого паттерна смены чередующихся волн у полифиодонтов. У рыб есть убедительные доказательства того, что сигналы, исходящие от зуба-инициатора в передней части челюсти, формируют зубной ряд или ряды (Huysseune et al., 2012; Gibert et al., 2019; Sadier et al., 2020) . Этот механизм также был предложен для рептилий, однако он не был протестирован (Edmund, 1969).Другие потенциальные механизмы, предложенные для рептилий, включают модель реакции-диффузии или модель «зоны торможения», которая создает промежутки между зубами, которые меняются в процессе роста, создавая возникающий паттерн чередующейся замены (Osborn, 1970, 1971; Westergaard and Ferguson, 1987; Murray and Kulesa, 1996; Fraser et al., 2008). Все эти модели были предложены на основе изучения зарождения зубов у эмбрионов, и поэтому до сих пор неизвестно, как паттерны цикличности зубов сохраняются у взрослых.

Замещение зубов у полифиодонтовых рептилий можно частично объяснить сохранением зубного эпителия на протяжении всей жизни (Handrigan et al., 2010; Wu et al., 2013; Salomies et al., 2019; Brink et al., 2020). У рептилий зубная пластинка может быть непрерывной вокруг челюстей, как у ящериц и змей, или представлять собой очаговые островки эпителиальных клеток рядом с функциональным зубом, как у крокодилов. Напротив, у большинства млекопитающих зубной эпителий претерпевает апоптоз пренатально (Buchtova et al., 2012), и только несколько клеток позади последнего зуба в дуге или в периодонтальной связке сохраняются после рождения. У леопардового геккона развитие зубов начинается на самом аборальном конце (наиболее удаленном от ротовой полости) или на свободном конце зубной пластинки. Ранняя зачатка проходит через типичные стадии развития зуба (зачаток, шляпка, колокольчик, гистодифференцировка, прорезывание), в конечном итоге попадая в ротовую полость. Зубная пластинка соединяет функциональный зуб с нижележащими замещающими зубами в каждом положении зуба.Дентальная пластинка продолжает расти на язычной стороне самого молодого зуба, образуя последующую пластинку. Каждый новый зуб прорастает из следующей пластинки, и цикл начинается снова. Эктомезенхима конденсируется вокруг почки, и обе ткани взаимодействуют, чтобы подвергаться морфогенезу и гистодифференцировке (Handrigan et al., 2010; Handrigan and Richman, 2011).

Зубная пластинка является вероятным источником эпителиальных стволовых клеток у полифиодонтовых рептилий (Handrigan et al., 2010; Wu et al., 2013). Предыдущая работа на леопардовом гекконе показала, что большинство клеток, сохраняющих метку (предполагаемые стволовые клетки), были расположены на лингвальной стороне зубной пластинки, примерно на полпути между последовательной пластинкой и ротовой полостью (Handrigan et al., 2010) . Клетки, сохраняющие метку, не проникали в зубы поколений, но вместо этого оказывались неподвижными и изолированными от других BrdU-положительных клеток. Однако предполагаемые стволовые клетки могут иметь другие ниши, близкие к оральному эпителию, как показано на бородатом драконе (Salomies et al., 2019). Клетки, сохраняющие метку, присутствовали в небольшом количестве в последовательной пластинке бородатого дракона (Salomies et al., 2019) и игуаны (Brink et al., 2020), но наблюдались только в выпуклости зубной пластинки (последовательной пластине) Американский аллигатор на преинициативной стадии развития зубов (Wu et al., 2013). Различия в близости к последовательным зубам и нехватка этих клеток, сохраняющих метку, означает, что все еще есть важные вопросы, которые необходимо решить относительно судьбы (или роли) этих предполагаемых стволовых клеток в развитии следующего поколения зубов.

Ранее проводились исследования, в которых пытались стимулировать замену зубов путем удаления функциональных зубов. У аллигаторов наблюдалось усиление пролиферации выпуклости зубной пластинки (Wu et al., 2013). Этот ответ в самой глубокой части зубной пластинки мог привести к ранней дифференциации последовательных пластинок, однако долгосрочное наблюдение не было включено в это исследование (Wu et al., 2013). У зеленой игуаны зубы также образовались раньше, чем ожидалось, после удаления функциональных зубов (Brink et al., 2020). Однако после раннего начала зубной цикл не изменился. Поскольку эти исследования игуан были сосредоточены на отдельных функциональных зубах в разных положениях вокруг рта, они не могли предоставить информацию о взаимоотношениях между соседними зубами или механизмами, способствующими формированию рисунка на всей челюсти. Таким образом, до сих пор не понятно, как нарушения одонтогенных тканей и развитие замещающих зубов влияют на время и структуру замены в контексте наиболее распространенных моделей замены зубов.

В этом исследовании мы стремились отследить влияние удаления зубов второго поколения и повреждения зубной пластинки на развитие последующих поколений зубов с использованием леопардового геккона, у которого известная продолжительность цикла выпадения зубов (Grieco and Richman, 2018 ) и популяции удерживающих метку клеток в зубной пластинке (Handrigan et al., 2010). Мы спрашиваем, повлияет ли удаление зубов второго поколения на формирование рисунка соседних зубов, будут ли предполагаемые стволовые клетки из зубной пластинки (удаленной от места расположения следующего зубного зачатка) давать начало следующему поколению зубов. и могут ли клетки зубной пластинки давать начало амелобластам, звездчатому ретикулуму и наружному эмалевому эпителию эмалевых органов.Мы предположили, что зубы будут регенерировать после заживления зубной пластинки, но это формирование рисунка будет нарушено из-за удаления сигналов между соседними зубами в хирургической области. Мы также предположили, что эпителиальные стволовые клетки из зубной пластинки будут вносить вклад во все слои эмалевого органа во вновь сформированных зубах. Наши результаты показывают, что после удаления зубов второго поколения формирование паттерна не сильно изменяется и что процесс регенерации зубов у геккона является устойчивым, поскольку непролиферативные, дентальные эпителиальные клетки-предшественники сохраняются в зубной пластинке.Кроме того, клетки, полученные из первоначально меченой зубной пластинки, вносят вклад во все слои эмалевого органа.

Материалы и методы

Операции по выживанию взрослых гекконов

Все процедуры с животными были одобрены Комитетом по уходу за животными UBC (протокол этики A15-0242). Колония леопардовых гекконов размещается в специальном помещении с 12-часовым циклом свет-темнота и подогреваемыми клетками. Животных выращивали из вылупившихся или покупали в розничных магазинах. Восемнадцать гекконов (15 самок и 3 самца) в возрасте от 2 месяцев до 1 года после вылупления и весом 13–75 г были подвергнуты оральным операциям.Некоторые люди использовались для экспериментов в нескольких временных точках на верхней и нижней челюстях (дополнительная таблица 1). Операции по выживанию проводились в хирургическом кабинете для животных с изофлурановым испарителем, смесителем O ₂, системой улавливания газа и флуоресцентным стереомикроскопом (MZFLIII).

Geckos получали мелоксикам 0,2 мг / кг перорально и 15 мг / кг кальцеина (Sigma-Aldrich, каталожный номер C0875) внутрибрюшинно за 24 часа до операции. Флуоресцентная этикетка из кальцеина быстро встраивается в минерализующую эмаль, дентин и кость.Животных индуцировали смесью 5% изофлуран / газ O ₂ в непрерывном потоке, и внутримышечные инъекции 20 мг / кг альфаксалона вводили с двух сторон в эпаксиальные мышцы. Местный анестетик вводили в небо или нижнюю челюсть перед операцией в виде инъекции (0,5% лидокаина, максимальная доза 7 мг / кг).

Квадранты полости рта были разделены на различные области лечения от 10 до 20 зубов: (1) энуклеация (хирургическое удаление) развивающихся зубов второго поколения, содержащих минерализованную ткань, с оставлением неминерализованных зубов на стадии зачатка третьего поколения, (2) энуклеация зубов второго поколения плюс вылечить окружающие ткани, таким образом удаляя и / или смещая эти ткани и неминерализованные зубы на стадии зачатка третьего поколения, и (3) ложные хирургические области, где слизистая оболочка языка была разрезана рядом с зубами и ретинирована лингвально с минимальным повреждением прилегающих тканей (Рисунки 1B – H).Смежные контрольные области, не подвергавшиеся манипуляции, также были изучены для оценки нормальных паттернов формирования паттерна и пролиферации.

Рисунок 1. Модель геккона полифиодонтового леопарда. (A) мкКТ-сканирование верхней челюсти геккона леопарда, показывающее замещающие зубы близко к углу между зубным и небным отростками верхнечелюстной кости (овальный контур). Минерализованные замещающие зубы встречаются вокруг дуги на разных стадиях развития. (B) Окрашенный гематоксилином и эозином срез верхней челюсти леопардового геккона, поперечная плоскость.Минерализованный зуб первого поколения или функциональный зуб соединен с зубами второго и третьего поколения зубной пластиной. Разрез, сделанный лингвально на зубе 1-го поколения, обнажает зуб 2-го поколения (пунктирная линия со стрелкой). Проекция небного отростка верхнечелюстной кости показана пунктирной линией под углом. Это анатомическая справочная информация о том, где можно ожидать образования новых зубов. (C) Зубы, меченные кальцеином, во время операции. Слизистая оболочка была надрезана и втянута, чтобы обнажить помеченные непрорезавшиеся зубы второго поколения. (D) Экспериментальный дизайн для операций по удалению зубов на верхней челюсти, который включает несколько участков по 10 зубов в каждом. Зубы третьего поколения формируются близко к небному отростку верхнечелюстной кости. (E) Схема, показывающая фиктивный хирургический контроль, при котором слизистая оболочка полости рта разрезана и отведена, но зубы и мягкие ткани не повреждены. (F) Энуклеация включает удаление зуба второго поколения (2 внутри круга), при этом пластинка зуба и зубы третьего поколения остаются на месте. (G) энуклеация с выскабливанием, включающая удаление зубов второго поколения (2 внутри круга) и выскабливание зубных тканей, повреждающих зубные и последующие пластинки. (H) Лингвальный вид области микроконтактной компьютерной томографии, показывающий специфику операции. Группа зубов была удалена сзади, в то время как передние зубы второго поколения остались нетронутыми. (I – K ’) Микро-КТ сканирование с контрастированием нижней челюсти через 1 неделю после операции. Несколько областей были обработаны в одном квадранте, чтобы максимизировать информацию, полученную от этого образца. (I ’) Хирургическая область энуклеации на виде спереди, показывающая наличие замещающих зубов третьего поколения и прямую зубную пластинку. (I ”) Энуклеация с хирургической зоной кюретажа на виде спереди, показывающая отсутствующие и смещенные замещающие зубы, а также более толстую зубную пластинку, которая может быть перекручена. (J, J ’) Поперечный срез контрольной области, показывающий зуб второго поколения и зубную пластинку. Пунктирной линией обозначена плоскость сечения в (I – I ”) . (K, K ’) Поперечный срез энуклеированной области, показывающий отсутствующий зуб второго поколения плюс оставшуюся зубную пластинку. Обозначение: 1- функциональный зуб 1-го поколения; 2- замещающий зуб второго поколения; 3- замещающий зуб третьего поколения; ab, аборальный; муравей, передний; б, кость; дл, зубная пластинка; dl twist, скрученная зубная пластинка; la, губной; ли, лингвальный; о, оральный; штифт, задний; ppmxb, небный отросток верхнечелюстной кости; sl, последующая пластинка.

Ножницы

для иридэктомии были вставлены в маргинальную слизистую оболочку с язычной стороны функциональных зубов (рис. 1B).Слизистую оболочку оттягивали тупым инструментом (аппликатор Dycal, стоматологический инструмент) для просмотра развивающихся зубов второго поколения, содержащих кальцеин (набор фильтров GFP; рис. 1C). Зубы третьего поколения не были видны, потому что они не минерализовались. Несколько участков были обработаны у одного животного (рис. 1D). В экспериментальных регионах минерализованные непрорезавшиеся зубы были удалены с помощью тонких щипцов №5 с (энуклеация + выскабливание) или без (энуклеация) разрушения зубного эпителия (Рисунки 1E – G).Для выскабливания ложку-экскаватор (стоматологический инструмент) перемещали кпереди-назад под слизистую оболочку, чтобы разорвать и сместить зубную пластинку. Синие шарики Affi-Gel (BioRad) имплантировали на каждый конец разреза для маркировки хирургической области в последующем гистологическом анализе. Фотографии были сделаны с использованием флуоресцентного и светлопольного стереомикроскопа до и после операции. За неделю до эвтаназии шести животным вводили 90 мг / кг ксиленола оранжевого (Sigma-Aldrich, cat.№ 398187) путем внутрибрюшинной инъекции для маркировки зубов, минерализовавшихся после операции (рис. 2А).

Рисунок 2. Динамика регенерации зуба. (A) Схема эксперимента, начинающегося слева. Кальцеин вводили однократно, за 24 часа до удаления зуба второго поколения. Функциональные зубы и зубы второго поколения помечены зеленым цветом. Зубы третьего поколения не минерализованы и не подлежат маркировке. Ксиленол оранжевый вводили за 1 неделю до 1, 2 и 3 месяцев (эвтаназия).Оранжевые зубы после операции минерализуются. Образцы заливки соответствуют определенным поколениям зубов. (B – J) Верхняя половина каждой панели представляет собой флуоресцентные изображения, полученные после фиксации со всеми присутствующими мягкими тканями. Сигнал частично скрыт слизистой оболочкой. Флуоресцентные оранжевые зубы были сопоставлены с эквивалентными зубами на изображениях μCT (нижняя половина), и только зубы с эксклюзивной оранжевой меткой были ложно окрашены. Черно-белые стрелки указывают волны замещения или зарождающиеся волны замещения в чередующихся положениях зубов. (B) Поддельный контроль — Большинство зубов имеют двойную маркировку с зелеными кончиками и оранжевым основанием, за исключением двух зубов, которые только зеленые и скоро будут заменены оранжевыми зубами (стрелки). (C) Энуклеация — три зуба полностью оранжевого цвета и прорезываются недавно (стрелки). (D) Энуклеация с выскабливанием — виден недавно прорезавшийся оранжевый зуб (стрелка). (E) Через 2 месяца после операции в фиктивном контроле многие зубы имеют двойную метку, а несколько прорезавшихся зубов имеют исключительно оранжевый цвет.Зеленые зубы скоро будут заменены (стрелки). (F, G) Через 2 месяца после энуклеации или энуклеации и кюретажа присутствуют зубы с двойной меткой, присутствуют исключительно оранжевые зубы, а иногда все еще присутствуют зеленые зубы (стрелки). Сканирование μCT показывает, что некоторые зубы третьего поколения неуместны. В (G) одна позиция зуба имеет 3 последовательных зуба (стрелка). (H) Через 3 месяца после операции в фиктивном контроле все зубы оранжевого цвета, что указывает на то, что после операции все они были заменены.Видимый зеленый цвет находится в нижней челюсти. (I, J) После энуклеации или энуклеации и выскабливания некоторые из исходных зеленых зубов сохранялись во рту дольше, чем ожидалось, по сравнению с контролем (стрелки). Сканирование μCT показывает, что зубы третьего поколения зарождаются по несколько нормальному чередующемуся образцу. Обозначения: муравей, передний; б, кость; столб, задний.

BrdU Pulse-Chase Experiment

Животным вводили 50 мг / кг бром-дезоксиуридина (BrdU, кат.B5002, Sigma-Aldrich) внутрибрюшинно один раз в день в течение 4 дней подряд, начиная с 3 дня после операции. Животных умерщвляли, как описано, в нулевой момент времени (сразу после 4-дневного пульса или через 1 неделю после операции), через 3 недели после BrdU (1 месяц после операции) и через 7 недель после BrdU (8 недель после операции).

Сканирование мкКТ

После эвтаназии изофлураном головы гекконов фиксировали в 4% параформальдегиде в течение не менее 24 часов при 4 ° C, промывали физиологическим раствором, заливали 2% агарозой и дегидратировали в 70% этаноле.Черепа сканировали с помощью μCT в Центре высокопроизводительной феногеномики (CHTP) Университета Британской Колумбии на Scanco Medical μCT100 с разрешением 17 мкм. Нижняя челюсть 1 животного обрабатывалась 0,7% раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты (PTA) -метанола в течение 7 дней для увеличения радиоконтрастности мягких тканей, согласно Metscher (2009). Нижняя челюсть была сканирована с помощью μCT в Центральноевропейском технологическом институте (CEITEC) Технологического университета Брно на GE phoenix v | фолиант | x м с разрешением 4 мкм.Окрашивание PTA несовместимо с гистологическими или молекулярными анализами. Все образцы с верхней челюсти были зарезервированы для молекулярных исследований.

Гистология и окрашивание иммунофлуоресценцией

После стандартного сканирования методом μCT части верхней и нижней челюсти геккона были разделены на сегменты с использованием ориентиров, записанных во время операции. Кусочки декальцинировали в 14% EDTA в течение не менее 3 месяцев при комнатной температуре на шейкере перед переработкой в парафин. Для определения участков, где проводились операции, были изготовлены тестовые слайды.Каждый 10-й срез блока был окрашен гематоксилином и эозином. Выбранные срезы размером 7 мкм из нескольких блоков помещали на предметные стекла так, чтобы условия окрашивания были эквивалентными для различных обработок. Множественные реплики зубов были помещены на несколько слайдов, что дополнительно подтвердило результаты (дополнительная таблица 2).

Срезы депарафинизировали и регидратировали до воды. Получение антигена для всего иммуноокрашивания выполняли с использованием Diva Decloaker (Biocare # DV2004MX).Для комбинированного окрашивания BrdU и PCNA срезы предварительно обрабатывали 0,1% тритоном-X в PBS в течение 10 минут, а затем блокировали в 10% козьей сыворотке, 0,1% Triton-X в PBS в течение 30 минут. Анти-BrdU (клон G3G4, банк гибридом для исследований развития, мышь 1:20) и анти-PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток, кроличий поликлональный, Abcam, # 18197, 1: 1000) смешивали вместе в блокирующем растворе и инкубировали в течение ночи при 4. ° C.

Для окрашивания PITX2, кератина и SOX2 срезы блокировали в 5% бычьей сыворотке, 0.1% Твина-20 в TBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Ткани инкубировали в течение ночи при 4 ° C в первичных антителах, разведенных в блокирующей сыворотке (поликлональные антитела овцы против PITX2, R&D Systems, # AF7388, 1: 500; анти-SOX2, поликлональные антитела кролика, Abcam # 97959, 1: 1000; антитела кролика против Pan -Кератин, Дако, каталожный номер Z062201-2, 1: 500).

Вторичные антитела применяли в течение 1 ч при комнатной температуре (все в разведении 1: 250, Life Technologies, Alexa Fluor 647 против ослиных овец, # A-21488; Alexa Fluor 488 козьих антимышиных, # A11029; козьих Cy5 против кроликов. , # A10523).Ядра контрастировали в Hoescht 33258 (Sigma, 10 мкг / мл) в течение 30 мин. Слайды были закреплены с помощью Prolong Gold (Invitrogen # P36934). Флуоресцентную визуализацию проводили с использованием объектива 20X на слайд-сканере Panoramic MIDI II с наборами фильтров 488, Cy5 и DAPI (3D Histech Ltd., Венгрия). Изображения были получены с помощью программы CaseViewer v.2.4.0.119028 (3D Histech Ltd., Венгрия).

Анализ распространения

Мы использовали программу CaseViewer для подсчета ядер, окрашенных BrdU, PCNA и Hoechst, в зубных пластинах.Включая и выключая каналы, можно было подтвердить ядра с двойной меткой. Общее количество зеленых, красных или двойных меченых клеток делили на количество клеток, окрашенных по Hoechst, в этом образце, чтобы получить процентную метку для этой зубной пластинки. Были приняты меры, чтобы разделить парафиновые срезы не менее чем на 250 микрон (ширина функционального зуба), чтобы анализировать зубы из разных семейств. Эти зубы, а не животные, считались индивидуальными биологическими копиями.Зубы для каждого из экспериментальных условий (энуклеация, энуклеация + выскабливание, имитация или контроль) объединяли от трех животных (дополнительная таблица 2). Мы сравнили процентную метку в двух временных точках (нулевой момент времени и 1 месяц), а также между четырьмя обработками, используя двухфакторный дисперсионный анализ (дополнительные таблицы 3A – D). Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism 9.0.2.

У животных, умерщвленных через 2 месяца, присутствовало мало меченых клеток, поэтому мы не вычисляли процентное соотношение (дополнительная таблица 4).Вместо этого мы определили исходное количество меченых клеток в различных областях эмалевого органа (внутренний эпителий эмали, внешний эмалевый эпителий и звездчатый ретикулум) и зубную пластинку зубов на стадии зачатка или шляпки (дополнительная таблица 4).

TUNEL Assay

Апоптоз оценивали с помощью анализа TUNEL с использованием набора ApopTag Apoptosis Kit (Millipore # S7111) и детектировали с использованием меченного флуоресцеином антитела против дигоксигенина, как описано ранее (Hosseini-Farahabadi et al., 2013).Проведена качественная оценка наличия TUNEL-положительных клеток.

Результаты

Наша цель в этом исследовании состояла в том, чтобы бросить вызов зубному ряду взрослых гекконов, намеренно нарушив замену зубов, тем самым инициируя реакцию заживления. Мы оставили функциональные зубы на месте и вместо этого удалили или энуклеировали непрорезавшиеся, частично минерализованные замещающие зубы (второе поколение) в отдельных областях челюсти леопардового геккона (рис. 1). Цель заключалась в том, чтобы оставить зубную пластинку позади плюс-минус незрелые зубы третьего поколения (неминерализованная почка или ранняя стадия колпачка).В более продвинутых зубах стадии кепки может присутствовать последующая пластинка. Цель состояла в том, чтобы проверить регенеративную способность зубного эпителия внутри челюстей.

Взрослый леопардовый геккон имеет примерно 40 функциональных зубов в каждом квадранте (рис. 1A), а в верхней челюсти каждый функциональный зуб соединен с двумя последовательными зубами через зубную эпителиальную пластинку (рис. 1B). Минерализованные непрорезавшиеся зубы второго поколения расположены на перегибе между зубным и небным отростками верхнечелюстной кости (рис. 1A) и находятся на различных стадиях формирования коронки (рис. 1A).Кроме того, в каждой семье есть зуб в зачатке или ранняя стадия шляпки до цитодифференцировки (третье поколение), которая видна только в гистологии (рис. 1B). Последовательная пластинка соединяется с наружным эпителием эмали зуба второго поколения и продолжает инициировать третье поколение зубов (рис. 1B). Для прямой визуализации зубов второго поколения во время операции мы вводили кальцеин, который быстро поглощался дентином и эмалевыми крышками (рис. 1C). Три вида лечения — имитация, энуклеация и энуклеация и выскабливание (рис. 1D – G) — начинались с лингвального разреза функционального зуба (рис. 1В).Этот разрез давал прямой доступ к зубам второго поколения (рис. 1С). Мы подтвердили, что зубы были удалены с помощью обычного сканирования μCT для всех образцов, которые впоследствии были использованы для гистологии (рис. 1H). Один квадрант нижней челюсти был обработан двумя операциями, зафиксирован через 1 неделю, затем окрашен фосфорновольфрамовой кислотой перед сканированием с высоким разрешением (рисунки 1I – K ’). Минерализованные замещающие зубы второго поколения все еще присутствуют в контрольных областях (Рисунки 1I, J, J ’). Однако в энуклеированных областях были успешно удалены замещающие зубы второго поколения (Рисунки 1K, K ’), а мягкие ткани с зубами третьего поколения все еще присутствуют (Рисунки 1I – I»).Почки равномерно расположены в энуклеированной области, в то время как в энуклеированной области с выскабливанием некоторые почки сгруппированы вместе по краям места лечения, а зубная пластинка более толстая и, следовательно, может быть перекручена (Рис. 1I »).

Восстановление нормальных паттернов замещения зубов через 3 месяца

Далее мы проследили восстановление зубного ряда. Животным вводили кальцеин за 24 часа до операции и ксиленол оранжевый за 1 неделю до эвтаназии, чтобы пометить зубы, которые сформировались de novo после операции (рис. 2А).Через 1 месяц контрольные области содержали в основном зубы с двойной меткой (зеленый кончик и оранжевая основа). Двойная этикетка показывала, что эти зубы присутствовали до операции (зеленый) и на них был добавлен новый дентин после операции (оранжевый). При последующем сканировании μCT совпадающей области зубы второго поколения видны в виде чередующейся волновой картины малых и больших зубов, увеличивающейся в размере к задней части челюсти (Рисунок 2B, черные и белые стрелки). По сравнению с сканированием μCT, зеленые зубы вот-вот будут заменены и активно не минерализуются (рис. 2B, стрелки).В обеих обработанных областях новые зубы, помеченные ксиленоловым оранжевым, были достаточно поверхностными, чтобы их можно было видеть сквозь слизистую оболочку (рисунки 2C, D, белые стрелки). Энуклеация и выскабливание мешали формированию рисунка de novo зуба (Рисунок 2D, черные стрелки) более серьезно, чем только энуклеация (Рисунок 2C, черные и белые стрелки). Кроме того, зубы скучены и неправильно ориентированы, что позволяет предположить, что зарождение и развитие зубов происходило в смещенных тканях (рис. 2D).

Через 2 месяца после лечения на контрольных участках видны преимущественно оранжевые зубы, что указывает на то, что они образовались недавно после введения кальцеина. Некоторые зубы все еще помечены двойной меткой, а некоторые имеют только зеленую метку кальцеина, что указывает на то, что они больше не активно минерализуются и скоро будут заменены (стрелки, рисунок 2E). Прорезавшиеся зубы, сохраняющие зеленую метку, находятся в положениях зубов, чередующихся с оранжевыми зубами, и при сопоставлении с развивающимися замещающими зубами можно увидеть волны в чередующихся положениях зубов, увеличивающихся в размере к задней части челюсти (Рисунок 2E, черные и белые стрелки. ).Нарушения нормального прорезывания все еще очевидны в тех регионах, где были удалены зубы (стрелки, рисунки 2F, G). При энуклеированной терапии новые минерализующиеся зубы появляются в виде чередования больших и маленьких зубов (рис. 3F, черные и белые стрелки), но не демонстрируют четкой картины постепенного увеличения размера в чередующихся положениях, как это видно на фиктивном контроле ( Рисунок 2E). В зоне энуклеации с кюретажем (рис. 2G) одно положение зуба показывает один функциональный зуб, который должен быть удален, только с зеленой меткой, и три частично минерализованных замещающих зуба, следующих за ним (белая стрелка).

Рисунок 3. Результаты стоматологического хирургического вмешательства по геккону, 24–72 часа. Гистологические срезы, окрашенные H и E, и соседние срезы, окрашенные антителом PCNA и антителом к панцитокератину (за исключением D – D ”). (A – A ”) Зуб второго поколения находится на продвинутой стадии колокола с отложениями дентина и эмали. PCNA-положительные клетки присутствуют в петлях шейки матки, последовательных пластинках и зубных пластинах. Антицитокератин маркирует эпителий. (B – B ”) При удалении зубов второго поколения остается место на месте зуба (2 с кружком вокруг).Зубная пластинка в основном не повреждена, и пролиферирующие клетки сосредоточены в последующих пластинках. (C – C ”) энуклеация и выскабливание вызвали разрыв зубной пластинки. Обрывки цитокератин-положительного эпителия присутствуют (C ’, C”) . Распространение в основном ограничивается предполагаемой последовательной пластинкой (черные стрелки, C ”). Через 72 часа началось заживление. (D – D ») Зубы с искусственной обработкой присутствуют и дифференцируются в ожидаемом месте.Пластинка зуба содержит много PCNA-положительных клеток (D ») . (E – E ”) Оставшаяся зубная пластинка продолжает иметь более высокую пролиферацию на аборальном кончике (E”) . Также имеется большое количество пролиферирующих мезенхимальных клеток (черные стрелки). (F – F ”) Разорванная зубная пластинка начинает заживать, наблюдается высокая пролиферация эпителия и мезенхимы (черные стрелки). Ключевые слова: ab, aboral; cl, шейная петля; дл, зубная пластинка; la, губной; ли, лингвальный; о, оральный; sl, последующая пластинка.Масштабные линейки = 100 мкм для изображений с малым увеличением (A – F ’) и 20 мкм для изображений с высоким увеличением (A” –F ”) .

Через три месяца после лечения каждый зуб в фиктивном контроле помечен оранжевым, что указывает на то, что все зубы были заменены (рис. 2H). Кость челюсти все еще помечена зеленым цветом (рис. 2H). На обработанных участках сохраняются зубы, содержащие только зеленую метку, дольше, чем можно было бы ожидать по сравнению с фиктивным контролем (Рисунки 2I, J, стрелки). Новые минерализующиеся зубы в обеих областях демонстрируют структуру чередующихся размеров зубов, приближающуюся к модели, наблюдаемой в поддельных контрольных областях (Рисунки 2I, J, черные и белые стрелки).

Ответ клетки на удаление непрорезавшихся зубов второго поколения

Мы показали, что после удаления зубов второго поколения происходит постепенное восстановление. Затем мы исследовали реакцию на тканевом уровне. Используя тест TUNEL, смерть клеток присутствует в зубной пластине и окружающей мезенхиме через 3 дня после операции в энуклеированных областях (дополнительные рисунки 1A, B). К 7 дню после операции наблюдается небольшое количество гибели клеток в мезенхиме, но нет TUNEL-положительных клеток в эпителии (дополнительные рисунки 1D, E).В фиктивных контрольных зубах не было TUNEL-положительных клеток. Клеточный мусор был очищен к 1 неделе.

Затем мы исследовали пролиферацию с помощью PCNA, чтобы определить, изменился ли паттерн пролиферирующих клеток в зубном эпителии и прилегающей мезенхиме в результате операции. Нормальный паттерн маркировки PCNA в зубах на стадии раструба должен иметь высокую пролиферацию в мезенхиме, шейных петлях и последовательных пластинках (Handrigan et al., 2010). Зубная пластинка обычно имеет гораздо меньшее разрастание (Рисунки 3A – A »).Зубы на стадии шляпки и зачатка на 100% помечены PCNA. В течение первых 24 часов после удаления зуба второго поколения в зубной пластине оставались PCNA-положительные клетки около аборального конца (Рисунки 3B – C »). Разрыв зубной пластинки не повлиял на рисунок (рис. 3С »). Имитация контроля, по-видимому, увеличила окрашивание PCNA в зубной пластине через 72 часа по сравнению с 24 часами (Рисунки 3D – D »). Самым четким изменением между 24 и 72 часами было увеличение метки PCNA в мезенхиме в области, где был удален зуб второго поколения (рисунки 3E ’, F’).Наиболее аборальное расширение зубной пластинки продолжало экспрессировать PCNA (Фигуры 3E », F»). Через 1 неделю пролиферация в имитационных контролях была аналогична необработанным зубным тканям (Рисунки 4A – A »). Мезенхимальная пролиферация была увеличена рядом с местом, где были удалены зубы второго поколения (Рисунки 4B – B »). В областях, где зубная пластинка была разорвана, пролиферация была отмечена около краев эпителия (Рисунки 4C – C »).

Рис. 4. Исходы стоматологического хирургического вмешательства по геккону, 1–2 недели.Гистологические срезы, окрашенные H и E, и соседние срезы, окрашенные антителом PCNA и антителом к панцитокератину. (A – A ”) В фиктивных контролях PCNA-положительные клетки присутствовали в последовательных пластинках. Нет окрашивания PCNA в мезенхиме, окружающей зуб, или между зубной пластиной и костью. Остается разрыв зубной пластинки от исходного разреза (черная стрелка). (B – B ”) Область, где был удален зуб, показана на (B) , и мезенхима в этой области имеет повышенное окрашивание PCNA (стрелки B’, B ”).Также присутствует сильное окрашивание PCNA на свободном конце зубной пластинки ( B ”, черная стрелка). (C – C ”) Пластинка зуба усечена, а клетки, расположенные ближе всего к разорванному краю, являются PCNA-положительными (стрелки). (D – D ») К 2 неделям заживление фиктивных контролей завершается, и в шейных петлях и последующих пластинках присутствует нормальное окрашивание PCNA. (E — F ’) При энуклеации и энуклеации + выскабливание зубы начинают развиваться в аборальном конце.В месте удаления зуба произошло сращение кости. Эпителий зубов PCNA-положительный. Клетки в зубной пластине также являются положительными, и на это не влияет местное разделение орального и аборального участков зубной пластинки (F ») . Мезенхимальное разрастание присутствует вокруг зачатков зубов (белые наконечники стрелок). Обозначение: 2, зуб второго поколения; ab, аборальный; б — костное отложение; cl, шейная петля; дл, зубная пластинка; la, губной; ли, лингвальный; м, мезенхима; о, оральный; sl — последующая пластинка; tb, зубная зачатка.Масштабные полосы = 100 мкм для изображений с низким увеличением и 50 мкм для (A ”–F”) . Бар в (A ”) применяется ко всем остальным.

Через две недели после операции фиктивные контроли продолжали иметь сильный сигнал в зубах второго поколения, в основном в шейных петлях и последовательных пластинках (рисунки 4D – D »). Мезенхимальный ответ изменился, и было очень мало окрашивания PCNA рядом с зубной пластиной (рисунки 4E ’, E”). Новая кость была видна на зубном отростке верхней челюсти (рис. 4E, F).Зубная пластинка продолжала экспрессировать PCNA около аборального конца и иногда можно было увидеть новые зубные зачатки (Figures 4F-F »). Зубная пластинка была разорвана в некоторых местах после выскабливания (рисунки 4F – F и дополнительные рисунки 2D, E), но это не повлияло на пролиферацию около аборального кончика зубной пластинки. Другие фенотипы зубной пластинки наблюдаются после хирургического вмешательства. К ним относятся кисты, образующиеся внутри зубной пластинки (дополнительные рисунки 2A – C), разрыв или усечение зубной пластинки (дополнительные рисунки 2D, E), утолщение или скручивание зубной пластинки (дополнительный рисунок 2F) и вращение развивающихся зубов ( Дополнительные рисунки 2G, H).Таким образом, после удаления зуба в неотлеченных областях зубная пластинка остается во всю длину, доходя до небного отростка верхнечелюстной кости или язычного отростка зубной кости (рисунки 3B, E и дополнительные рисунки 2A, B). Признаков ретракции зубного эпителия на ложных участках хирургического вмешательства не обнаружено. У нас не было специфического маркера для последовательной пластинки, но казалось вероятным, что выщипывание минерализованного зуба, вероятно, влечет за собой любую прикрепленную последовательную пластинку (как на рисунках 4A, D).

Затем мы исследовали экспрессию PITX2, маркера одонтогенного потенциала, в нормальном развитии зубов и в тканях с дисморфными зубными пластинками. В контрольных тканях белок PITX2 экспрессируется в эмалевом органе, шейных петлях и последовательных пластинках развивающихся зубов на всех стадиях (Рис. 5A – A »). Напротив, в других областях зубной пластинки было очень мало положительных клеток (10% клеток в ротовой трети были PITX2-положительными, N = 22 по сравнению с 60% клеток рядом с зубом, n = 35).Сразу после операции экспрессия PITX2 в разорванной зубной пластинке незначительна (Figures 5B-B ”), за исключением наиболее аборального расширения в некоторых случаях (Figures 5C-C”). Через 1 неделю аналогичный низкий уровень сигнала наблюдался в оральных частях укороченной зубной пластинки (Рисунки 5D – D »). К 2 неделям только кусочки зубной пластинки, которые были расположены близко к типичному положению зачатка зуба третьего поколения, показали зарождение новых зубов, даже несмотря на то, что в укороченных оральных частях были некоторые клетки с экспрессией PITX2 (Рисунки 5E – F ”’).Таким образом, идентичность зубов сохранялась в аборальном зубном эпителии, даже несмотря на то, что пространственная информация могла быть зашифрована. Мы предположили, что эпителиально-мезенхимальные взаимодействия, необходимые для образования зубов, поддерживаются только в определенных местах глубоко в мезенхиме челюсти.

Рисунок 5. Экспрессия PITX2 в необработанном и обработанном зубном эпителии. Поперечные срезы окрашивают H и E, а соседние срезы окрашивают антителом против PITX2 (красный) и ядерным красителем Hoechst (синий). (A – A ”) Семейство предчелюстных зубов с тремя последовательными зубами. Зубной эпителий эмалевых органов является PITX2-положительным. (B – B ”) Через 72 часа после операции пластинка зуба сохраняет слабое окрашивание PITX2. (C – C ”) К 7 дню на пластинках зубов в некоторых местах появляются кисты. Окрашивание ядра PITX2 видно только на самом аборальном конце ( C ”, стрелки). (D – D ») Через неделю после операции. В областях с короткой зубной пластиной наблюдается очень слабое ядерное окрашивание PITX2 ( D» и на вставке показан канал PITX2).В этом разделе находится бусинка, обозначающая начало операционного поля. (E – E ”’) Через две недели после энуклеации и выскабливания костное сочленение присутствует близко к тому месту, где был удален зуб. Существует разделение между оральным и аборальным участками зубной пластинки. В ротовой части есть несколько ячеек возле разорванного края с окрашиванием PITX2 ( E ”, и вставка). В аборальной пластинке зуба начинает формироваться зачаток зуба из остатков пластинки зуба, и видно сильное ядерное окрашивание ( E ”’ , наконечники стрелок и вставка). (F – F ”’) . Есть разделение между оральным и аборальным участками зубной пластинки. Наиболее сильное ядерное окрашивание наблюдается в зарождающемся зачатке зуба и аборальном конце зубной пластинки (стрелки в F ”’ и вставка). Обозначение: 2, зуб второго поколения; 3 — зуб третьего поколения; 4 — зуб четвертого поколения; ab, аборальный; б, кость; быть, бусинка; в, киста; cl, шейная петля; cont, control; дл, зубная пластинка; en — энуклеация; д + с, энуклеация и выскабливание; la, губной; ли, лингвальный; sl — последующая пластинка; sr, звездчатая сетка.Масштабные линейки = 100 мкм для малых увеличений и 50 мкм для больших увеличений (A ”–F” , E ”’, F ”’) .

Мы исследовали вторую метку зубного эпителия и метку, идентифицирующую предполагаемые стволовые клетки. SOX2 маркирует клетки-предшественники у некоторых млекопитающих (Juuri et al., 2012) и рептилий (Juuri et al., 2013; Kim et al., 2020), акул (Martin et al., 2016) и бородатого дракона (Salomies et al. ., 2019). В отличие от этих других животных и в отличие от экспрессии, обнаруженной у эмбриональных гекконов (Juuri et al., 2013) или молодых гекконов (Kim et al., 2020), не было окрашивания антителами SOX2 в зачатке зуба или последующих пластинках (дополнительный рисунок 3B в этом 1-недельном контрольном срезе нижней челюсти). Различия между нашими исследованиями могут быть связаны с возрастом животных. Животные, использованные для окрашивания SOX2, были взрослыми особями, а не подростками или эмбрионами. В зубной пластинке экспрессия минимальна, некоторые ядра около ротовой полости окрашиваются незначительно. Во вкусовых рецепторах наблюдается сильное окрашивание, что свидетельствует о перекрестной реакции антитела с белком SOX2 геккона (дополнительный рисунок 3C).SOX2-положительные клетки во вкусовых луковицах были комплементарны PCNA-положительным клеткам (дополнительный рисунок 3C), как сообщалось ранее у мышей (Castillo-Azofeifa et al., 2018). Точно так же в зубе нет перекрытия между PCNA-положительными и SOX2-положительными клетками. Есть некоторые области зубной пластинки, где видно перекрывающееся окрашивание (дополнительные рисунки 3E, E ’).

Мы также исследовали экспрессию SOX2 через 1-2 недели после операции (дополнительные рисунки 4A – H »). Через 1 неделю после операции наблюдаются аналогичные картины окрашивания, состоящие из легкого окрашивания SOX2 в ядрах центральной и оральной части дентальной пластинки (дополнительные рисунки 4A – D »).Через 2 недели мы идентифицировали SOX2-положительные клетки в оральной части зубной пластинки, а иногда и в аборальной зубной пластине. Эти качественные наблюдения не подтверждают изменение количества или расположения SOX2-положительных клеток после операции. Эти животные не были помечены BrdU, поэтому прямое сравнение SOX2-положительных и BrdU-положительных клеток невозможно.

BrdU Pulse-Chase зубных эпителиальных клеток для отслеживания потомства клеток, сохраняющих метку

Чтобы определить, предполагаются ли ранее стволовые клетки в зубной пластине (Handrigan et al., 2010) приводят к появлению новых зубов, мы выполнили импульсный анализ BrdU (рис. 6–9). Основываясь на динамике экспрессии PCNA, пролиферация в зубной пластине была максимальной через 3-7 дней после операции (Рисунок 3). Поэтому мы начали вводить BrdU через 3 дня после операции и продолжали 4 дня. Мы ожидали, что будем маркировать предполагаемые стволовые клетки, которые могли быть активированы в ответ на травму. Мы проанализировали несколько зубов у трех разных животных (дополнительная таблица 2).

Рисунок 6. Разрастание в зубной пластине вслед за пульсом. (A) Включение BrdU +/- PCNA относительно общего количества клеток в зубной пластине было значительно выше в обработанном и фиктивном контроле по сравнению с контрольными образцами без манипуляций в момент времени 0. Через 1 месяц не было никаких изменений. существенные различия между видами манипуляции. Кроме того, количество меченых клеток было таким же в контроле, как и в нулевой момент времени. (B) Маркировка PCNA была значительно выше в момент времени 0 по сравнению с 1-месячной послеоперационной дентальной пластиной, за исключением контрольной дентальной пластинки. (C) В момент времени 0 клетки с двойной меткой присутствовали в значительно более высоких пропорциях между контролем и всеми экспериментально обработанными тканями. Не было значительной разницы между процентом клеток с двойной меткой в момент времени 0 и 1 месяц в контроле. Другие обработанные ткани имели значительно более низкую метку через 1 месяц по сравнению с моментом 0. (D) Доля клеток BrdU + PCNA / PCNA была очень высокой в обработанных тканях во время 0 по сравнению с контролями. Кроме того, количество меченых клеток в контроле было выше в момент времени 0 по сравнению с 1 месяцем после погони.Звездочки: * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001.

Рисунок 7. Максимальная маркировка от 4-дневного импульса BrdU — время 0. Экспериментальная парадигма проиллюстрирована выше. Через три дня после операции начинается пульс BrdU, который продолжается 4 дня. Животных умерщвляют после импульса через 0, 1 или 2 месяца. Срезы окрашивали H и E, а соседние срезы использовали для двойного мечения BrdU (зеленый) и PCNA (красный). (A – A ”’) Контрольный верхнечелюстной зуб без манипуляций после 4-дневного импульса BrdU. Пролиферирующие амелобласты заняли метку (A ’) , так же как петли шейки матки и последовательные пластинки (A”) . Наименее зрелый зачаток зуба захватывается в соседней флуоресцентной секции (A ”) . Большая часть внутреннего эпителия эмали имеет двойную маркировку (желтые стрелки). BrdU почти не захватывается звездчатым ретикулумом. (A ”’) Дентальная пластинка в основном помечена PCNA, но также присутствует несколько клеток, меченных только BrdU (зеленые стрелки).Есть также несколько транзитных усиливающих клеток с двойной меткой (синие стрелки). Красное пятно — неспецифическое пятно. (B – B ””) Поддельный зуб, который подвергался цитодифференцировке во время маркировки. (B ’) Видна оригинальная этикетка из кальцеина. Постмитотические амелобласты не были маркированы, тогда как петли шейки матки и последовательные пластинки были сильно маркированы. (B ”) Дентальная пластинка содержала намного больше BrdU-положительных клеток, чем контроль (B” ’) , и многие из клеток были дважды помечены PCNA (сравните B” ’с B” ”). (C – C ””) Удаление зуба привело к сильной маркировке BrdU по всей зубной пластине. Разделенные каналы показывают, что многие клетки PCNA помечены совместно с BrdU. Обозначение: 2, зуб второго поколения; а — амелобласты; ab, аборальный; ca, кальцеин; cl, шейная петля; г — дентин зуба первого поколения; дл, зубная пластинка; iee, внутренний эпителий эмали; la, губной; ли, лингвальный; pma, постмитотический амелобласт; о, оральный; sl — последующая пластинка; sr — звездчатая сетка; tac, транзитная усиливающая клетка; tb, зубная зачатка.Масштабные линейки = 100 мкм в (A, A ’, B, C, C’) . Все остальные стержни = 20 мкм.

Рис. 8. Сохранение этикеток BrdU через 1 месяц и совместное мечение с PCNA. Пять зубов (A – E) взяты из разных регионов одного и того же животного. BrdU — зеленый, PCNA — красный, ядра — синие. Оси в A относятся ко всем панелям. (A – A ”) Семейство зубов с BrdU, оставшимся в некоторых клетках в зубном зачатке третьего поколения (A’) . Большая часть пластинки зуба помечена PCNA, но не BrdU (A ») .Амелобласты, образовавшиеся во время введения метки, поглотили BrdU (A ”) . (B – B ”) Зубная зачатка второго поколения была помечена кальцеином, а амелобласты помечены BrdU. Новейшая эмаль наносится между этикеткой из кальцеина и кончиком бугорка. Большая часть BrdU была захвачена постмитотическими амелобластами, поэтому этому зубу около 1 месяца. Пластинка зуба содержит множество клеток с двойной меткой, которые являются транзитными клетками-амплификаторами (синие стрелки).Некоторые клетки, сохраняющие метку, помечены только BrdU (зеленые стрелки). (C – C ”) Многие клетки, меченные BrdU (зеленые стрелки) и клетки с двойной меткой (желтые стрелки), находятся в зачатке нового зуба и шейной петле зуба второго поколения. Дентальная пластинка также имеет маркировку BrdU (C ”) . (D – D ») Новый зачаток зуба, отсутствующий во время операции. Во внутреннем эпителии эмали и звездчатом ретикулуме имеются клетки с двойной меткой (желтые стрелки, D ’).Дентальная пластинка имеет несколько клеток BrdU (зеленые стрелки) и несколько соседних транзитных усиливающих клеток (синие стрелки). (E – E ”) Зубной зачаток третьего поколения, который имеет меченые клетки во внутреннем эпителии эмали ( E’ , желтые стрелки). Дентальная пластинка имеет интерстициальные клетки, меченные BrdU, и несколько транзитных амплифицирующих клеток (синие стрелки). Обозначение: 2, зуб второго поколения; 3 — зуб третьего поколения; а — амелобласты; ab, аборальный; ca, кальцеин; cl, шейная петля; дл, зубная пластинка; д, эмаль; iee, внутренний эпителий эмали; la, губной; ли, лингвальный; о, оральный; pma; постмитотический амелобласт; sr — звездчатая сетка; tb, зубная зачатка.Масштабные линейки = 20 мкм для (A’ – E «) , 50 мкм для (A, D) и 100 мкм для (B, C, E) .

Рис. 9. Сохранение этикеток BrdU через 2 месяца и совместное мечение с PCNA. Поперечные срезы зубов из разных областей верхней челюсти, окрашенные H и E. Соседние срезы использовали для иммунофлуоресцентного окрашивания. (A – B ”’) Зубы второго поколения сохранили фрагменты BrdU в ядрах постмитотических амелобластов. (B ”’) Клетки, удерживающие метку, присутствуют в зубной пластине между зубами второго и третьего поколения (зеленые стрелки). (C – C ”’) Дифференцирующий зуб имеет BrdU-удерживающие клетки в звездчатом ретикулуме (зеленые стрелки). Клетки с двойной меткой разбросаны по петлям шейки матки. (C ”’) В зубной пластинке имеется несколько BrdU и транзитных амплифицирующих клеток (синие стрелки). (D – D ”’) Семейство зубов с зубом второго поколения, которое на момент операции находилось в стадии зачатка.Новейшая зубная зачатка, полученная из последовательных пластинок зуба второго поколения, содержит клетки с двойной меткой во внутреннем и внешнем эпителии эмали. Пластинка зуба продолжает нести слабо меченые BrdU-положительные клетки (зеленые стрелки, D ”’ ). (E – E ””) Зуб на стадии раструба, на котором только что началось отложение эмалевой матрицы. Фрагменты BrdU находятся в амелобластах и эпителиальных клетках наружной эмали. Во время первоначальной операции этот зуб был в начальной стадии зачатка.Последовательная пластинка, возникшая после операции, содержит клетки, меченные BrdU (зеленые стрелки). Обозначение: 2, зуб второго поколения; 3 — зуб третьего поколения; а — амелобласты; ab, аборальный; cl, шейная петля; cont, control; дл, зубная пластинка; en, эмалевый матрикс; iee, внутренний эпителий эмали; la, губной; ли, лингвальный; о, оральный; oee, наружный эпителий эмали; sl — последующая пластинка; sr, звездчатая сетка. Масштабные линейки = 100 мкм для изображений с малым увеличением и 20 мкм для (A’ – E ”’) .

Нулевое время, нормальные модели распространения и максимальное включение BrdU

Один геккон был немедленно умерщвлен после 4-дневного импульса BrdU (7 дней после операции, животное 9) для определения максимальной доли меченых клеток в момент времени 0 при различных условиях обработки (рисунки 6, 7 и дополнительные таблицы 1, 2).Мы также исследовали 2 других животных только с маркировкой PCNA (животные 5 и 11, дополнительные таблицы 1, 2). PCNA должен присутствовать в клетках, которые находились в поздней фазе перехода G1, S и G2 в M (Kurki et al., 1986), и эта метка представляет нормальную пролиферацию в ткани в этот момент времени. Напротив, BrdU последовательно добавляли животным в течение 4 дней. Следовательно, клетки, входящие в S-фазу в любой из 4 дней, будут помечены кумулятивно. Недостаточно времени для разбавления оригинальной этикетки BrdU между 1 и 4 днями.

Нас особенно интересовало, заставила ли операция обычно покоящиеся клетки зубной пластинки делиться и поглощать BrdU. В контрольных регионах было менее 20% клеток зубной пластинки, которые были BrdU-положительными с меткой PCNA или без нее (BrdU +/- PCNA; Фигуры 6A, 7A – A и дополнительная таблица 3A). Напротив, в обработанных областях приблизительно 50% клеток зубной пластинки были помечены BrdU +/- PCNA (Фигуры 6A, 7B – C »). Этот уровень включения был значительно выше, чем в контроле (Фигуры 6A, P <0.01, дополнительная таблица 3A). Эти результаты позволяют предположить, что втягивание слизистой оболочки при имитации стимулирует включение BrdU. Мы также оценили количество клеток, которые только что имели метку BrdU в момент времени 0 (дополнительная таблица 2 и дополнительный рисунок 5). Это клетки, не участвующие в клеточном цикле, о чем свидетельствует отсутствие окрашивания PCNA. BrdU-положительные клетки могли быть стимулированы к делению сразу после операции, но до эвтаназии клетки вошли в G0 или в ранний G1 и, следовательно, были PCNA-отрицательными (Kurki et al., 1986).

В контрольной и фиктивной контрольной областях все терминально дифференцированные постмитотические амелобласты, которые присутствовали до операции, не были помечены (фиг. 5B ’). Метка кальцеина, видимая в минерализованном дентине или эмали, позволяет отличить зубы, которые присутствовали во время операции (Рисунок 5B ’).

Процент мечения PCNA в зубной пластинке представляет клетки в клеточном цикле во время эвтаназии. Не было разницы между обработками и контролями в момент времени 0 (Фигуры 6B, 7A ”’ — C ”’ и дополнительная таблица 3B).Исходя из этих данных, мы не можем исключить изменение базального уровня пролиферации по сравнению с животным, не перенесшим хирургического вмешательства.

Затем мы подсчитали, насколько эффективно мы пометили клетки, находящиеся в клеточном цикле, с помощью BrdU. Сначала мы посмотрели на долю клеток с двойной меткой из всей популяции клеток зубной пластинки (меченные BrdU + PCNA, рисунок 6C). Было отмечено значительно больше клеток по сравнению с контрольными пластинками зубов (дополнительные таблицы 3A, C и рисунки 6C, 7B », C»).В соответствующем анализе доля клеток, меченных BrdU + PCNA, среди всех PCNA-положительных клеток была выше (70–78%, фиг. 6D и дополнительные таблицы 3A, D), чем в контрольных пластинках зубов. Таким образом, мы определили популяцию однократно меченых, BrdU-положительных клеток в зубной пластине, которые не участвовали в клеточном цикле. Следовательно, это могут быть предполагаемые клетки-предшественники или стволовые клетки. Операция не повлияла на долю этих медленно делящихся клеток. Однако операция значительно увеличила количество меченных BrdU клеток, вступающих в клеточный цикл (BrdU + PCNA).

Через месяц после операции

Мы обследовали трех животных через 3 месяца после операции (рисунок 8 и дополнительный рисунок 6). К 1 месяцу после операции было трудно найти порванные зубные пластинки, поэтому кажется, что они полностью зажили (дополнительные рисунки 2G, H, 5D, E). Мы не можем определить, произошло ли заживление из зубной пластинки, прорастающей от краев дефекта, был ли аборальный рост более короткой, разорванной зубной пластинки или их сочетание. Обычно прорезавшийся зуб остается на месте примерно 5–8 недель, пока он функционирует (рисунки 2E, H; Grieco and Richman, 2018).Затем прорезывается зуб второго поколения, и проходит 4 недели до прорезывания зуба третьего поколения (рис. 2H). Таким образом, через 1 месяц после удаления зубов второго поколения мы оцениваем, что зубы третьего поколения, вероятно, прогрессировали до цитодифференцировки. Будут сформированы зубы после операции, которых изначально не было. Они достигли бы стадии кепки, но амелобласты бы не дифференцировались. При фиктивном или неуправляемом контроле мы увидим, что зуб второго поколения сформировал полную коронку и резорбирует зуб 1-го поколения.

Этикетка BrdU служит двум целям через 1 месяц после операции. Первый — дифференцировать предполагаемые стволовые клетки от транзитных усиливающихся клеток в зубной пластине. Наиболее медленно делящиеся недифференцированные клетки зубной пластинки будут сохранять большую часть единственной метки BrdU (ядро будет заполнено сигналом флуоресценции) и, что важно, не будут помечены PCNA. Клетки зубной пластинки, которые имеют двойную метку фрагментированным BrdU и PCNA, вероятно, являются транзитными амплифицирующими клетками.Вторая цель состоит в том, чтобы различать три типа зубов: (1) те, которые сформировались из существующей зубной зачатки, присутствующей во время операции, (2) те, которые образовались сразу после операции, и (3) те, которые сформировались de novo через несколько недель после операции от оставшейся зубной пластинки. Присутствие терминально дифференцированных постмитотических немеченых амелобластов в сочетании с кальцеиновой меткой (видимой при УФ-освещении срезов) указывает на первый тип зуба, зубной зачаток, который присутствовал и частично дифференцировался до проведения операции.Второй тип зубов будет иметь амелобласты, которые полностью помечены BrdU, но стали постмитотическими почти сразу после операции. de novo , или третий тип зубов, достигнет стадии шляпки или зачатка, будет строго маркирован PCNA и будет иметь часть клеток, также помеченных фрагментированным BrdU. Обратите внимание, что ксиленоловый оранжевый присутствовал в образцах, но не был сохранен после обработки для гистологии.

В контрольной группе без манипуляций большие зубы второго поколения присутствовали в ожидаемом месте.Как и предполагалось, большинство амелобластов не улавливали BrdU, потому что они были постмитотическими (фигура 8A и дополнительная фигура 6A), однако наименее зрелые амелобласты были помечены и затем перестали делиться (фигура 8A »и дополнительная фигура 6A»). Зубы третьего поколения присутствовали от стадии зародыша до стадии колокольчика. В зубах на стадии зачатка было очень мало BrdU-положительных клеток (фиг. 8A ’). Пластинка зуба была очень слабо маркирована (рис. 8А »). Такая же картина наблюдалась у фиктивных контролей (рис. 8В).Зубы третьего поколения, которые присутствовали во время операции, можно было легко отличить по наличию кальцеиновой метки и сильно меченных секреторных амелобластов (Фигуры 8B, B ’и дополнительные Фигуры 6B, B’). Зубные зачатки в фиктивных областях, которые изначально не присутствовали, были помечены на всех участках эмалевого органа (Фигуры 8C, C ’и дополнительные Фигуры 6C, C’). В тех областях, где были удалены зубы второго поколения, большинство аборальных зубов, расположенных рядом с небным отростком верхнечелюстной кости, находились в стадии зачатка или шляпки (Рисунки 8D – E ’).Эти зубы были слегка помечены фрагментированным BrdU во внутреннем эпителии эмали, который также был PCNA-положительным (Фигуры 8D-E ’). Эти двойные меченые клетки в наименее зрелых зубах повышают вероятность того, что оригинальные BrdU-меченые клетки в дентальной пластинке дали начало всем слоям эмалевого органа новых зубов.

Транзитные амплифицирующие клетки являются первым потомством стволовой клетки, которое образуется после асимметричного деления клетки. Таким образом, транзитные амплифицирующие клетки должны сохранять большую часть исходной метки BrdU и находиться в непосредственной близости от ниши стволовых клеток (Yu and Klein, 2020).Зубные пластинки фиктивных контрольных и обработанных зубов имели клетки, удерживающие метку, плюс несколько транзитных усиливающих клеток рядом (Рисунки 8B ”–E”).

Наша количественная оценка пролиферации дентальной пластинки через 1 месяц у трех животных показала, что процент клеток, меченных BrdU +/- PCNA, и другие связанные вычисления значительно снизились по сравнению с нулевым моментом времени (Рисунки 6A, C, 8A – E »). Не было существенной разницы в контрольных зубах между 0 и 1 месяцем (рисунки 6A, C, 8A и дополнительная таблица 4A).Интересно, что не было значительной разницы в доле исключительно BrdU-меченных клеток между 0 и 1 месяцем (дополнительная фигура 5). Цифры довольно сильно различались между разделами, поэтому статистическая значимость не была достигнута (дополнительная таблица 2 и дополнительный рисунок 5). Тем не менее, в большинстве срезов зубная пластинка сохранила довольно много предполагаемых стволовых клеток (Рисунки 8B ”–D”, E ’). Доля клеток BrdU + PCNA / PCNA значительно снизилась между 0 и 1 месяцем (рис. 6D).Частично разница была связана с уменьшением общей маркировки BrdU через 1 месяц (Рисунок 6B). Данные PCNA из зубной пластинки предполагают, что в момент времени 0 животное действительно отреагировало на операцию общим увеличением пролиферации (возможно, общей стрессовой реакцией), но к 1 месяцу гомеостаз был восстановлен. Уровень маркировки PCNA, наблюдаемый в контроле в момент времени 0, существенно не отличался от контроля через 1 месяц и, следовательно, представляет собой типичный уровень пролиферирующих клеток в зубной пластине.

Зубы, которые присутствовали на стадии колокола во время операции, независимо от типа лечения, часто имели маркировку кальцеином, но амелобласты на вершине бугорка не были маркированы, потому что они были постмитотическими (рисунки 8A, C). Зубы, которые во время операции находились на стадии колпачка или на ранней стадии колокольчика, накапливали BrdU в амелобластах, а затем перестали делиться (Рисунок 8B ’). Как и предполагалось, зубы, которые либо отсутствовали, либо находились на ранней стадии зародыша, перешли либо в стадию зародыша, либо в стадию шляпки, но не до стадии колокольчика.Эмалевые органы и последовательные пластинки этих зубов имели сильную маркировку PCNA, но также присутствовали некоторые BrdU-положительные клетки (Рисунки 8A ’, C’-E’). О подобном паттерне окрашивания в последовательной пластинке (сильная PCNA с меньшим количеством клеток, меченных BrdU) сообщили другие (Kim et al., 2020). Мы не определяли количественно долю клеток с двойной меткой в зубах через 1 месяц после операции, поскольку она сильно варьировала.

Через два месяца после операции

Мы обследовали трех животных через 2 месяца после операции.К сожалению, у двух животных не было достаточного проникновения фиксатора, поэтому большая часть зубов произошла от одного животного (Рисунки 9A – E ””, Дополнительные Рисунки 7A – B ”’ и Дополнительная Таблица 4).

Исходя из времени смены зубов, к 8 неделям зубные зачатки, которые были в стадии зачатка или шляпки во время операции, достигли бы положения № 2 и вступили бы в стадию позднего колокольчика или стадию гистодифференцировки (Рисунки 9A – E). Зубные зачатки, которых не было во время операции, должны быть на ранней стадии зародыша (Рисунки 9A, B, D).Зубы колоколообразной стадии, как в контрольных, так и в обработанных тканях, имели BrdU во внутреннем эпителии эмали (Рисунки 9A », B», E »). Также были фрагменты BrdU, присутствующие в наружном эпителии эмали (Рисунки 9A ”, B” ’, C” –E ”). Зубы на стадии зачатка, которые отсутствовали во время операции, содержали меченые клетки в наружном и внутреннем эпителии эмали, большинство из которых были помечены двумя метками (Рисунки 9D, E и Дополнительные Рисунки 7A, B). Частое присутствие BrdU +/- PCNA клеток в дентальной пластинке после удаления зубов второго поколения и присутствие фрагментированного BrdU в новых зачатках зубов предполагает, что дентальная пластинка вносит вклад в следующее поколение зубов.Пластинка зуба удерживала BrdU-положительные клетки во всех обработанных и контрольных тканях (дополнительная таблица 4 и рисунки 9C ”’, D ”’, E ””). Были клетки, помеченные PCNA и BrdU, и в зависимости от их расположения в зубной пластинке они могли быть транзитными амплифицирующими клетками. Часть клеток зубной пластинки была помечена только BrdU, и это, вероятно, недифференцированные, медленно делящиеся клетки-предшественники.

Обсуждение

Это исследование временно нарушило замену зубов у взрослых гекконов путем выборочного удаления непрорезавшихся минерализованных зубов второго поколения.Заживление пластинки зуба и возобновление замены зубов — это надежный процесс, который к 3 месяцам приблизился к нормальному состоянию. Хотя были части зубной пластинки, которые были разорваны, и последующая пластинка была разрушена, зубная пластинка сохранила одонтогенную идентичность, зажила, и произошло формирование зуба de novo . Мы также представляем первые данные по сравнению нормальных и заживающих зубных пластинок у взрослых животных. Мы также определили, что даже несмотря на то, что изначально зубы формировались намного ближе, чем обычно, в разрушенных зубных и последующих пластинках, не было никакого торможения развития.Как только начинается последующее поколение зубов, зубы формируются как независимые единицы в правильном положении, глубоко в челюстях, на основе локальной эпителиально-мезенхимальной передачи сигналов.

Время замены и формирование зубного ряда взрослого геккона контролируется местными, а не региональными факторами

Наша работа частично проверила гипотезу о том, что в зубных рядах взрослых рептилий существуют диффузные сигналы, действующие между семействами зубов, проходящие на большие расстояния в челюсти, чтобы установить паттерн замены зубов (Edmund, 1969).Работа на других моделях животных показала, что существует зона торможения между соседними зубами у цихлид (Fraser et al., 2008) и зубчиков кожи акулы (Cooper et al., 2018), которые устанавливают паттерн. В наших экспериментах по энуклеации минерализующиеся зубы были удалены, но зубная пластинка, последующие пластинки и любые зубы на стадии зачатка, которые не имели флуоресцентно меченой минерализующейся ткани, остались в челюсти. Это объясняет быстрое восстановление, при котором зубы, которые уже сформировались, сохраняли время и структуру последующего образования зубов.В кюретированных участках обработки некоторые зубные зачатки были сдвинуты близко друг к другу или скручены в разные положения, но все же продолжали развиваться, даже несмотря на то, что предполагаемая зона ингибирования была нарушена. Это говорит о том, что, если она присутствует у рептилий, зона ингибирования является более важной до начала расстановки зубных рядов, но менее важна, когда зубы начинают дифференцироваться. Мы признаем, что необходимы другие эксперименты, чтобы определить, что произошло бы с паттерном инициации, если бы все зубы третьего поколения были удалены в определенной области.

Мы отметили через две недели после операции, что зубы зарождаются только в самых аборальных участках дентальной пластинки. Поучительные сигналы к началу формирования зубов могут находиться либо в мезенхиме, либо в эпителии. В настоящее время у нас отсутствуют маркеры одонтогенной мезенхимы и нет метода разделения двух тканей in vivo . О потенциальных молекулах, которые могут участвовать в формировании локального паттерна в зубном ряду рептилий, сообщалось в исследовании бородатого дракона (Salomies et al., 2019).Эти авт. Выполнили объемное секвенирование РНК специально на последовательных пластинках и окружающей мезенхиме, используя ткани, выделенные с помощью микродиссекции с лазерным захватом. Были представлены некоторые кандидатные мезенхимальные гены, но многие из них не аннотированы. Необходима дополнительная работа в области биоинформатики, чтобы найти потенциальные поучительные сигнальные пути, участвующие в индукции зубов у взрослых рептилий.

Для своевременного выпадения зубов могут потребоваться сигналы от непрорезавшихся зубов

Наши данные свидетельствуют о том, что пластинка зуба содержит информацию для правильного моделирования формирующихся зубов, и сигналы не исходят от зуба второго поколения.Однако для резорбции функционального зуба может потребоваться зуб второго поколения. Мы обнаружили, что функциональный зуб оставался во рту дольше, чем ожидалось, и не заменялся до тех пор, пока не появился заменяющий зуб, чтобы резорбировать его. Важность резорбции зубов в поддержании времени цикла зуба также была показана в исследованиях, в которых функциональный зуб был сломан, но не удален, у рыб (Huysseune et al., 2012) и игуан (Brink et al., 2020). На сроки замены зуба у игуан не повлияло разрушение коронки зуба, так как основание все еще требовало резорбции перед выпадением.Зубы геккона, по-видимому, требуют сигналов от замещающего зуба, чтобы инициировать резорбцию функциональных зубов.

Время начала замены зубов не ускоряется после энуклеации зуба

Помимо влияния на резорбцию зубов, наши данные не показывают доказательств более раннего образования зубов после энуклеации замещающих зубов. Зубные зачатки, которые присутствовали во время операции, нормально развились после лечения, о чем свидетельствует наличие небольших минерализованных зубов на снимках микроконтактной компьютерной томографии.Аналогичное присутствие зубов третьего поколения на ранних стадиях гистодифференцировки было замечено в гистологии. Возможно, лучшим доказательством отсутствия ускорения темпов развития зубов являются данные PCNA. Через 1 месяц наблюдалось снижение, а не увеличение маркировки PCNA в зубной пластине во всех условиях, включая контроль. Сами зубы маркируются PCNA аналогичным образом через 0, 1 и 2 месяца. Новые зубы, как только они инициируют морфогенез, обладают высокой пролиферацией, и это не зависит от того, были ли удалены зубы второго поколения.

Наши результаты отличаются от результатов для аллигатора, где удаление функционального зуба вызвало пролиферацию и образование новых зубов раньше, чем ожидалось (Wu et al., 2013). О долгосрочном эффекте удаления зубов у аллигаторов еще не сообщалось. Таким образом, неизвестно, влияет ли пролиферация в конечном итоге на формирование зубов или одна и та же группа клеток становится неподвижной в течение определенного периода времени. У зеленой игуаны разрастание сукцессионной пластинки происходит только тогда, когда зуб инициируется, поэтому периоды покоя между событиями инициации гораздо более продолжительны, чем у леопардового геккона (Brink et al., 2020). У геккона всегда есть новые зачатки в большинстве положений зубов, и все последующие пластинки разрастаются, как показывает маркировка PCNA. Эта готовность к образованию новых зубов может объяснить более быстрое вращение зубов у геккона по сравнению с игуаной (4–5 недель у гекконов, Grieco and Richman, 2018; по сравнению с 10–20 неделями у игуан, Brink et al., 2020).

Маркировка BrdU-PCNA позволяет отличить предполагаемые стволовые клетки от их потомства по расположению и фрагментации BrdU

Впервые об удержании метки BrdU было сообщено в пластинке зуба, рядом с зубами второго поколения (Handrigan et al., 2010). В этом исследовании отмечалось удержание меченых клеток в недифференцированной зубной пластине и в наружном эпителии эмали дифференцирующихся зубов. Также ранее сообщалось о поглощении BrdU в амелобластах, которые собирались дифференцироваться и стать постмитотическими (Handrigan et al., 2010). В настоящем исследовании мы объединили маркировку PCNA и BrdU, что добавило к истории. Во-первых, с более высоким разрешением мы смогли увидеть, что сохранение BrdU варьируется по качеству (степени фрагментации) и количеству (количеству клеток) в зависимости от местоположения и стадии дифференцировки зачатков зубов.Во-вторых, мы могли отличить клетки, несущие BrdU, который, вероятно, вошел в G0, от клеток, которые вошли в клеточный цикл (BrdU + PCNA). В предыдущем исследовании подсчет клеток включал клетки, меченные BrdU +/- PCNA. Некоторые из клеток, вероятно, были транзитными амплифицирующими клетками, а не исключительно клетками, сохраняющими метку BrdU. В предыдущем исследовании было высказано предположение, что в новых зубных зачатках будет потомство транзитных усиливающих клеток, которые в конечном итоге будут вносить вклад в различные слои эмалевого органа.Здесь мы обнаружили, что удаление зубов второго поколения позволило нам отделить вклад клеток, удерживающих метку в зубной пластине, от тех, которые могут присутствовать в самом зубе.

Две интерпретации клеток, меченных BrdU — Дедифференцировка по сравнению со стволовыми клетками / клетками-предшественниками

Недавнее исследование показало, что в условиях химической абляции частично дифференцированные клетки внутреннего эпителия эмали в резцах мыши могут превращаться в клетки-предшественники (Sharir et al., 2019). Идея о том, что ткани могут регенерироваться, даже если местная популяция стволовых клеток почти истощена, была продемонстрирована в кишечнике и других органах (Gola and Fuchs, 2021; Shivdasani et al., 2021).

Мы считаем маловероятным, чтобы BrdU-позитивные клетки в зубной пластине геккона были окончательно дифференцированы, а затем в ответ на повреждение дедифференцировались в клетки-предшественники. Чтобы первая часть гипотезы была верной, зубная пластинка должна иметь характеристики дифференцированного эпителия.Признаков расслоения, как в некератинизированном эпителии полости рта, нет (Groeger, Meyle, 2019). Поскольку эпителиальные клетки около базальной мембраны являются пролиферативными и недифференцированными во всех слоистых эпителиях (Gola and Fuchs, 2021), любые постмитотические, терминально дифференцированные клетки будут ограничены центром дентальной пластинки. Однако у геккона и бородатого дракона BrdU-положительные клетки расположены близко к базальной мембране, часто рядом с клетками с двойной меткой. В исследовании из другой лаборатории (Kim et al., 2020) срезы зубов геккона леопарда окрашивали антителами к белку базальной мембраны ламинину5. Экспрессия в последовательной пластинке была диффузной и не формировала четких очертаний эпителия, как у мышей. Это согласуется с тем, что последовательные пластинки не являются дифференцированным эпителием. Структура базальной мембраны вокруг зубной пластинки еще не исследована. Зубная пластинка не выполняет барьерную функцию, как другие эпителии полости рта, и, следовательно, не требует специализированных клеточных соединений на поверхности.Кроме того, мы показали, что экспрессия PITX2 ограничена эпителием, который принадлежит одонтогенному клону, тогда как большая часть дентальной пластинки имеет меньшее количество PITX2-положительных клеток. Если бы дедифференцировка была основным механизмом в формировании новых зубов, мы бы увидели потерю окрашивания PITX2 в аборальных частях дентальной пластинки.

Концепция дедифференцировки зубного эпителия будет поддерживаться увеличением экспрессии маркеров стволовых клеток.Однако SOX2 не экспрессируется в большей части дентальной пластинки гекконов, где часто обнаруживаются BrdU-меченные клетки. Кроме того, после операции не было повышенного сигнала для SOX2. Дальнейшие эксперименты по совместной локализации будут выполнены для проверки экспрессии SOX2 и других маркеров стволовых клеток по отношению к сохраняющим метку клеткам у геккона.

Интересно, что сразу после травмы наблюдалось увеличение количества клеток BrdU + PCNA. Это говорит о том, что операция стимулировала большее количество клеток, которые изначально находились в покое, чтобы войти в клеточный цикл.Однако количество клеток, меченных только BrdU, не изменилось между исходным временем 0 и 1 месяцем. Зубной ряд геккона должен иметь возможность поддерживать минимальное количество стволовых клеток на протяжении всей жизни.

Двойное мечение с помощью PCNA и BrdU отделяет клетки, усиливающие транзит, от стволовых клеток ткани взрослых

Транзитные усиливающие клетки играют важную роль в регенерации зубных рядов. Традиционно считается, что транзитные амплифицирующие клетки близки к стволовым клеткам, но не имеют маркеров эпителиальных стволовых клеток, таких как Lgr5 и Sox2 (Binder et al., 2019). Клетки, усиливающие транзит, также являются пролиферативными (Yu and Klein, 2020). Самым убедительным доказательством того, что эти клетки с двойной меткой в зубной пластине являются ТА-клетки, является хирургический дизайн исследования и тот факт, что после удаления зубов второго поколения остались только зубная пластинка или незрелые зубные зачатки. Оставшиеся зубные зачатки, видимые в возрасте 1 месяца как зубы на стадии шляпки, были очень пролиферативными и содержали фрагментированный BrdU. Напротив, основным местом с ядрами, которые были полностью помечены BrdU, была зубная пластинка.

В настоящем исследовании мы смогли точно идентифицировать ядра, которые либо имели чистую метку BrdU, либо чистую метку PCNA, либо и то, и другое. Клетки с двойной меткой присутствовали во многих различных местах в зубном эпителии, но, согласно другим исследованиям, в резце мыши (Harada et al., 1999) и волосяном фолликуле (Hsu et al., 2014; Yang et al., 2017), только клетки с двойной меткой, близкие к нише стволовых клеток, следует рассматривать как транзитные амплифицирующие клетки. Напротив, недифференцированные эпителиальные клетки (не амелобласты), которые были помечены только BrdU, почти всегда локализовались в зубной пластине, за исключением нескольких случаев в звездчатом ретикулуме.Эти меченные BrdU клетки, вероятно, были эквивалентом стволовых клеток взрослой ткани, обнаруженных в основании волосяных фолликулов (Yang et al., 2017; Gola and Fuchs, 2021).

Наша работа не идентифицирует последовательный лабиолингвальный паттерн, где ранее мы сообщали, что большинство BrdU-меченных клеток находились на язычной поверхности дентальной пластинки (Handrigan et al., 2010). Мы объясняем эту разницу тем фактом, что в настоящем исследовании мы отобрали гораздо больше зубов и наши методы визуализации были более продвинутыми.Кроме того, некоторые языковые клетки в предыдущем исследовании имели двойную метку, но не были идентифицированы как таковые.

Наша новая модель состоит в том, что некоторые из транзитных усиливающих клеток, расположенных в пластинке зуба, перемещаются или смещаются в сторону почкующихся зубов. Действительно, мы часто находили скопления клеток с двойной меткой очень близко к зубу внутри зубной пластинки. Движение клеток от оральной к аборальной части зубной пластинки также наблюдалось у бородатого дракона (Salomies et al., 2019). Этот направленный поток клеток в зубной пластинке может направлять рост зубов в более глубокие, а не поверхностные области челюсти.

Существует очень мало моделей для изучения стволовых клеток взрослых зубов, за исключением резца мыши и зубов некоторых рептилий. Мышь имеет очевидное преимущество в том, что она может отслеживать родословную с помощью генетических маркеров. В качестве заместителя для отслеживания клонов здесь использовалась степень разбавления метки BrdU и местонахождение потомства.Мы показали, что BrdU-меченные клетки, находящиеся в зубной пластине, как правило, более полно мечены BrdU, чем сильно фрагментированные BrdU-меченные клетки в зубных зачатках. Таким образом, меченные BrdU клетки могут поддерживать подмножество потомства с менее частыми клеточными делениями, в то время как другие подмножества делятся более быстро и дают начало зубам. Эти клетки, меченные BrdU, по-видимому, мультипотентны. Взрослый леопардовый геккон обладает необходимыми свойствами для понимания стволовых клеток зубного эпителия. Постоянная замена зубов производится более чем в 40 положениях зубов на квадрант, поэтому существуют надежные механизмы для поддержания гомеостаза тканей, поддающиеся экспериментальным исследованиям.Мы проверили, может ли целенаправленное удаление участков зубной пластинки (выскабливание) замедлить формирование зуба. Примечательно, что целостность зубной пластинки была восстановлена в период от 2 недель до 1 месяца после операции. Как показано на снимках μCT, задержки в формировании сменных зубов не было. Мы связываем быстрое заживление с сохранением стволовых клеток в остатках зубной пластинки. Мы прогнозируем, что более серьезное лечение, такое как химическая абляция (Sharir et al., 2019), может дать другие результаты.Принимая во внимание нормальную склонность зубной пластинки к поддержанию гомеостаза, вместе со способностью зубной пластинки к легкому заживлению и сохранением единичных клеток, меченных BrdU, в течение нескольких месяцев, наши данные подтверждают идею о том, что зубная пластинка содержит зубной эпителиальный ствол. клеточная популяция.

Заявление о доступности данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Комитетом по уходу за животными Университета Британской Колумбии.

Авторские взносы

КБ и JMR: концептуализация, выполнение экспериментов, анализ данных и составление рукописи. ТГ: концептуализация, проведение экспериментов, анализ данных, редактирование рукописи. JIH: редактировал рукопись, иммуноокрашивание, анализ пролиферации клеток. JIH и JRMC: анализ распространения. KF: иммуноокрашивание. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Эта экспериментальная работа финансировалась грантом NSERC RGPIN-2016-05477 и грантом NIH 5R21DE026839-02 JMR.Финансирование хирургического набора для гекконов было получено из гранта NSERC RTI-2016-00117 JMR. KB финансировалась стипендией Киллама для получения докторской степени, Фондом Майкла Смита для постдокторских стажировок по исследованиям в области здравоохранения и стипендией для постдокторантов NSERC Banting. TG финансировалась индивидуальной докторской стипендией NIH F32 F32DE024948.

Конфликт интересов

TG в настоящее время работает в компании STEMCELL Technologies. Все лабораторные работы, выполненные TG, были выполнены до приема на работу в STEMCELL Technologies.STEMCELL Technologies не имеет никакого финансового или экспериментального участия в этой работе.

Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

За помощь в гистологии мы благодарим следующих студентов программы Worklearn: Джен Купер, Кайлин Хо, Куини Ли, Баян Нуреддин и Фелар Ю. За помощь в проведении экспериментов и плодотворные обсуждения мы благодарим сотрудников лаборатории JMR Томаса Бертена и Сида Вора.За помощь в уходе за животными мы благодарим ветеринаров и персонал Центра сравнительной медицины UBC. Мы благодарим Центр высокопроизводительной феногеномики при UBC за обычные микроКТ-сканирование гекконов и Томаса Зикмунда из CEITEC, Брно, Чешская Республика, за рентгеновское сканирование челюсти геккона с контрастным усилением.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2021.576816 / полный # дополнительный материал

Список литературы

Биндер, М., Хмиларц, П., Маккиннон, П. Дж., Биггс, Л. К., Теслефф, И., и Балик, А. (2019). Функционально отличительные рецепторы Ptch создают мультимодальную передачу сигналов Hedgehog в нише эпителиальных стволовых клеток зуба. Стволовые клетки 37, 1238–1248. DOI: 10.1002 / стержень.3042

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бринк, К. С., Ву, П., Чуонг, К. М., и Ричман, Дж. М. (2020). Влияние преждевременного удаления и повреждения зубов на время замены у зеленой игуаны. Integr. Comp Biol. 60, 581–593. DOI: 10.1093 / icb / icaa099

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бухтова, М., Стембирек, Дж., Глокова, К., Маталова, Э., Такер, А. С. (2012). Ранняя регрессия зубной пластинки лежит в основе развития зубных рядов дифиодонта. J. Dent Res. 91, 491–498. DOI: 10.1177 / 0022034512442896

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кастильо-Азофейфа, Д., Зайдель, К., Гросс, Л., Голден, Э. Дж., Жакес, Б., Кляйн, О. Д. и др. (2018). Регуляция SOX2 с помощью передачи сигналов hedgehog контролирует гомеостаз лингвального эпителия взрослых. Разработка 145: 164889.

Google Scholar

Купер, Дж. С. (1966). Замена зубов при медленном черве (Anguis Fragilis). J. Zool. 150: 235. DOI: 10.1111 / j.1469-7998.1966.tb03006.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Купер, Р. Л., Тиери, А. П., Флетчер, А.Г., Делбарре, Д. Дж., Раш, Л. Дж., И Фрейзер, Г. Дж. (2018). Древний механизм формирования рисунка, подобный Тьюрингу, регулирует развитие дентикулов кожи у акул. Sci. Adv. 4: eaau5484. DOI: 10.1126 / sciadv.aau5484

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эдмунд А.Г. (1960). Явления замещения зубов у низших позвоночных. Contribut. Life Sci. Div. 52, 1–190.

Google Scholar

Эдмунд А.Г. (1962). Последовательность и частота замены зубов у Crocodilia. Contribut. Life Sci. Div. 56, 7–42.

Google Scholar

Эдмунд А.Г. (1969). «Зубы», в «Биология рептилий». Морфология A , ред. К. Ганс, А. Белларис и Т. Парсонс (Лондон: Academic Press), 117–200.

Google Scholar

Гиберт Ю., Самарут Э., Эллис М. К., Джекман В. Р. и Лауде В. (2019). Первый сформированный зуб служит сигнальным центром, вызывающим формирование зубного ряда у рыбок данио. Proc.R Soc. B Biol. Sci. 286: 0401. DOI: 10.1098 / rspb.2019.0401

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грико, Т. М., и Ричман, Дж. М. (2018). Координация двустороннего замещения зубов у молодых гекконов продолжается с формированием паттерна in ovo. Evol. Dev. 20, 51–64. DOI: 10.1111 / ede.12247

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ханаи, Т., и Цуйхиджи, Т. (2019). Описание онтогенеза и паттернов замещения зубов у ювенильного Tarbosaurus bataar (Dinosauria: Theropoda) с использованием данных компьютерной томографии. Анат. Рек. 302, 1210–1225. DOI: 10.1002 / ar.24014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хендриган, Г. Р., Люнг, К. Дж., И Ричман, Дж. М. (2010). Идентификация предполагаемых зубных эпителиальных стволовых клеток у ящерицы с пожизненной заменой зубов. Dev. 137, 3545–3549. DOI: 10.1242 / dev.052415

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Харада, Х., Кеттунен, П., Юнг, Х. С., Мустонен, Т., Ван, Ю. А., и Теслефф, И. (1999). Локализация предполагаемых стволовых клеток в зубном эпителии и их связь с передачей сигналов Notch и FGF. J. Cell Biol. 147, 105–120. DOI: 10.1083 / jcb.147.1.105

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хоссейни-Фарахабади, С., Гита-Логанатан, П., Фу, К., Ниммагадда, С., Янг, Х. Дж., И Ричман, Дж. М. (2013). Двойная функция WNT5A во время развития хряща и при болезни. Matrix Biol. 32, 252–264. DOI: 10.1016 / j.matbio.2013.02.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Huysseune, A., Vandenplas, S., De Groeve, B., Fjelldal, P. G., and Hansen, T. (2012). Структура зубных рядов нижней челюсти у выращиваемого атлантического лосося (Salmo salar): инструмент для изучения механизмов замещения зубов? J. Appl. Ихтиол. 28, 330–335. DOI: 10.1111 / j.1439-0426.2012.02002.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Юури, Э., Jussila, M., Seidel, K., Holmes, S., Wu, P., Richman, J., et al. (2013). Sox2 отмечает способность эпителия образовывать зубы у млекопитающих и рептилий. Dev. 140, 1424–1432. DOI: 10.1242 / dev.089599

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Juuri, E., Saito, K., Ahtiainen, L., Seidel, K., Tummers, M., Hochedlinger, K., et al. (2012). Стволовые клетки Sox2 + вносят вклад во все эпителиальные клоны зуба через предшественников Sfrp5 +. Dev. Cell 23, 317–328.DOI: 10.1016 / j.devcel.2012.05.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ким, Э. Дж., Юнг, С. Ю., Ву, З., Чжан, С., и Юнг, Х. С. (2020). Sox2 поддерживает пролиферацию эпителиальных клеток в последовательной зубной пластине. Cell Prolif. 53: e12729. DOI: 10.1111 / cpr.12729

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Клайн, Л. В., и Каллум, Д. (1984). Долгосрочное исследование феномена замены зубов у молодой зеленой игуаны, игуаны-игуаны. J. Herpetol. 18, 176–185. DOI: 10.2307 / 1563746

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Курки П., Вандерлаан М., Долбеар Ф., Грей Дж. И Тан Э. М. (1986). Экспрессия ядерного антигена пролиферирующих клеток (Pcna) / циклина во время клеточного цикла. Exp. Cell Res. 166, 209–219. DOI: 10.1016 / 0014-4827 (86)

-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мартин, К. Дж., Раш, Л. Дж., Купер, Р. Л., Метчер, Б. Д., Йохансон, З., и Фрейзер, Дж. Дж. (2016). Предшественники Sox2 + у акул связывают развитие вкуса с эволюцией регенеративных зубов из дентикулов. Proc. Natl. Акад. Sci. U S A 113, 14769–14774. DOI: 10.1073 / pnas.1612354113

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Метчер, Б. Д. (2009). MicroCT для биологии развития: универсальный инструмент для высококонтрастной трехмерной визуализации с гистологическим разрешением. Dev. Дин. 238, 632–640. DOI: 10.1002 / dvdy.21857

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мюррей, Дж.Д. и Кулеса П. М. (1996). О динамическом механизме реакции-диффузии: пространственное формирование зачатков зубов у аллигатора. J. Chem. Soc. -Faraday Transact. 92, 2927–2932. DOI: 10,1039 / фут9969202927

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сэдье, А., Джекман, У. Р., Лауде, В., и Гиберт, Ю. (2020). Зубной ряд позвоночных: инициируется ли он единичным зубом? Bioessays 42: 1

9. DOI: 10.1002 / bies.201

9
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Саломиес, Л., Эйманн, Дж., Хан, И., и Ди-Пой, Н. (2019). Альтернативная регенеративная стратегия бородатого дракона раскрывает ключевые процессы, лежащие в основе обновления зубов позвоночных. Элиф 8: 47702. DOI: 10.7554 / eLife.47702
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Шарир А., Марангони П., Зилионис Р., Ван М., Вальд Т., Ху, Дж. К. и др. (2019). Большой пул активно вращающихся предшественников управляет самообновлением и восстановлением повреждений эктодермального придатка. Нац. Cell Biol. 21, 1102–1112. DOI: 10.1038 / s41556-019-0378-2
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Вестергаард Б. и Фергюсон М. В. Дж. (1987). Развитие зубов у Alligator-Mississippiensis. Позднее развитие нижней челюсти эмбрионов, детенышей и молодых особей. J. Zool. 212, 191–222. DOI: 10.1111 / j.1469-7998.1987.tb05984.x
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Wu, P., Wu, X., Jiang, T.-X., Elsey, R.M., Temple, B.L., Divers, S.J., et al. (2013). Специализированная ниша для стволовых клеток позволяет многократно обновлять зубы аллигатора. Proc. Natl. Акад. Sci. США 110, E2009 – E2018.
Google Scholar
Есть ли у леопардовых гекконов зубы? Могут ли они кусаться?
Один из вопросов, который задают начинающие хранители рептилий, — есть ли у леопардовых гекконов зубы. Что ж, у большинства гекконов и ящериц есть зубы, приспособленные для захвата насекомых и червей.
Как вы хорошо знаете, леопардовые гекконы — насекомоядные, и им также нужны особые зубы для охоты, жевания и самообороны.
Зубы леопардового геккона трудно заметить, но их больше сотни. Конечно, они крошечные и аккуратно расставлены в соответствии с их особым способом питания.
Теперь вы знаете, что у «львов» есть зубы, но это все? Неа! Продолжайте читать, чтобы узнать об их зубах, замене зубов и о том, могут ли эти гекконы кусаться.
Структура зубов леопарда геккона
Развитие зубов у леопардовых гекконов обычно начинается на ранней стадии и не прекращается, пока геккон не умирает. У этого геккона зубы начинают развиваться еще до того, как он вылупляется.
Исследования показывают, что их зубы развиваются из эктодермальных клеток. Эти клетки приспособлены утолщаться и расти внутрь, образуя зубную пластинку.
Затем пластинка зубов соединяет зубы геккона с эпителием ротовой полости.
Как и у большинства гекконов, у львов есть ряды маленьких конусовидных зубов, которые выстилают зубную кость (расположенную в нижней челюсти), а также верхнечелюстную и предчелюстную кости (расположены на верхней челюсти).
У гекконов на верхней челюсти больше зубов, чем на нижней.Точное количество зубов трудно определить из-за многократной потери и замены зубов.
У здорового леопардового геккона в среднем должно быть от 50 до 100 зубов.
Замена зубов леопардового геккона
Как упоминалось выше, у леопардовых гекконов зубы развиваются только после смерти. Кроме того, они то и дело теряют зубы, а это значит, что их нужно заменять, чтобы выжить и нормально питаться.
Согласно данным Development Biology Interactive, у леопардовых гекконов есть целые семейства зубов, которые образуют ряды во рту.Эти ряды несут в себе новые поколения зубов, которые постоянно образуются в течение жизненного цикла геккона. Эти зубы будут расти под поверхностью челюстей и будут расти до тех пор, пока они не вылезут и не вытеснят существующие зубы.
Восстановление зубов леопардового геккона является жизненно важным элементом. Это объясняет, почему эти гекконы меняют зубы каждые 3-4 месяца. У гекконов должны быть полностью функциональные зубы, чтобы охотиться, есть и защищаться.
Кусают ли леопардовые гекконы?
Леопардовые гекконы, как и любое другое животное, могут укусить, если чувствуют угрозу.Обратите внимание на слово «под угрозой». Так что не стоит ожидать, что ваш геккон просто укусит вам палец или руку из уныния.
На самом деле леопардовых гекконов любят, когда их держат в руках , и они будут оставаться спокойными до тех пор, пока наслаждаются. Проблема возникает, если вы начинаете переусердствовать или удерживать его против его воли.
Исходя из моего опыта работы с леопардовыми гекконами, детеныши и молодые особи могут вас укусить с большей вероятностью, чем их взрослые особи. К счастью, агрессивность пройдет по мере роста геккона и привыкания к обращению с ним.
Некоторые укусы леопардовых гекконов случаются случайно. Например, гекконы могут укусить вас при кормлении с руки. Вот почему мы предпочитаем пользоваться щипцами, а не голыми руками.
Болят ли укусы леопардового геккона?
Если вы хотите завести домашнего геккона леопарда, то вам обязательно нужно знать, причиняют ли ему боль укусы. Все боятся укусов других животных, включая гекконов.
Хотя у львов около 100 зубов, их укусы редко причиняют боль. Помните, что их челюсти недостаточно сильны, чтобы проявлять силу.Кроме того, их зубы слишком малы, чтобы проникнуть в кожу. Это означает, что укус леопардового геккона редко приводит к кровотечению.
На самом деле, большинство людей, которых укусили эти гекконы, говорят, что их укусы кажутся простой царапиной. У вас нет причин опасаться укусов леопардовых гекконов.
Ядовиты ли леопардовые гекконы?
Если предположить, что леопардовый геккон укусил вас и проткнул вашу кожу, что произойдет? Что ж, от укуса может появиться кровь, но хорошо то, что их зубы не несут никакого яда.
Вам даже не нужно ехать в больницу, чтобы лечиться. Просто промойте рану водой с мылом, и все будет в порядке.
Завершение
Из нашего подробного описания ясно, что у леопардовых гекконов есть особые ряды зубов на верхней и нижней челюсти. Они используют свои сложные зубы, чтобы охотиться, удерживать и жевать насекомых. Кроме того, они могут использовать их в качестве защитного механизма, если чувствуют угрозу или загнаны в угол.
Зубы рептилий: детали зубов рептилий
Зубы рептилий
В зоологии ведение документации является важной частью науки.Эта отрасль разветвляется на множество биологических разделов, включая анатомию животных и физиологию, изучающие, как животные работают функционально. К ним относятся функции организма и детали, такие как глаза, органы и зубы! Обычно для классификации животных, в том числе рептилий, используют зубы. В этой статье мы упрощаем и описываем общие типы зубов рептилий. (Для подробного исследования посетите Google Scholar и воспользуйтесь поисковой системой для научных журналов.)
Барри Берковиц, Питер Шеллис, Зубы позвоночных, не являющихся млекопитающими, 2017
Три типа зубов рептилий: (слева направо) зубы текодонта, зубы плевродонта и зубы акродонта
Этот тип классификации проливает свет на нынешнюю жизнь животных, а также на ее историческую и эволюционную жизнь.Понимание зубов и их развития помогает нам лучше понимать животных в целях сохранения, разведения и ведения учета. Чем больше мы понимаем детали, характерные для видов, тем лучше мы можем их сохранить и оценить!
Что касается зубов, то особые зубные образования позволили животным, в том числе людям и рептилиям, адаптироваться к специфическим и условно-патогенным диетам. Это помогло рептилиям выжить в дикой природе, в то же время позволяя нам попытаться воссоздать наиболее естественные условия в неволе (диета).
Есть много разных типов зубов у позвоночных, и это ключевая характеристика при сравнении рептилий с млекопитающими. Зубы рептилий более однородны, чем у млекопитающих, у которых есть специализированные, разные зубы, предназначенные для жевания. Форма зубов рептилий по-прежнему зависит от вида, но есть общие черты — как и у всех зубов позвоночных, есть коронка и корень. Есть несколько исключений, таких как черепахи и черепахи, которые являются единственными беззубыми рептилиями. Вместо этого у них есть острые клювы, которые помогают им питаться разнообразными растительноядными, всеядными и плотоядными диетами.Единственные существующие в настоящее время рептилии (есть много исключений для окаменелостей и вымерших видов), у которых нет однородных зубов, — это крокодилы и ядовитые змеи.
У рептилий наиболее распространены три типа зубов или «зубные образования». Зубы Акродонта, Плевродонта и Текодонта. Способность отращивать зубы у позвоночных называется полифиодонтией и типична для позвоночных, не являющихся млекопитающими, таких как рептилии. Генетическое понимание этой регенерации плохо изучено.Основные различия при сравнении зубов животных заключаются в форме, расположении и том, выпадают ли они. У рептилий форма зубов зависит от вида и обычно одинакова, но есть исключения, такие как ядовитые змеи, челониане и крокодилы. Как и у млекопитающих, зубы рептилий состоят из эмали, дентина, цемента и пульпы. Эмаль — это внешняя часть зуба, которая поддерживает его прочность, дентин находится под эмалью, а цемент подобен «цементу», который прикрепляет зуб к челюстной кости.Цемент окружает и защищает пульпу, состоящую из нервов и кровеносных сосудов. Каждый тип зуба имеет различную конструкцию крепления и прочность, описанную ниже.
Зубья Acrodont
Зубы Акродонта самые слабые и не имеют прочного прикрепления внутри челюсти. Вместо этого они фактически срастаются с самой костью челюсти. Это образование зубов наблюдается у ящериц, таких как хамелеоны, уромастики, драконы с оборками и бородатые драконы. У ящериц есть зубы как акродонта, так и плевродонта.
Поскольку зубы Acrodont прикреплены к челюсти поверхностно и не глубоко в кости, их можно легко сломать, приложив достаточно усилий. Об этом следует помнить при кормлении и обращении с рептилиями с таким образованием зубов. Зубы акродонта также более восприимчивы к бактериальным и грибковым инфекциям, таким как гниль во рту. Согласно журналу о питании позвоночных, опубликованному Science Direct, зубы акродонта имеют короткие корни и прочное прикрепление. Зубы акродонтов обычно заострены, чтобы помочь пережевывать пищу.Зубы Acrodont не заменяются, но новые зубы могут врастать по мере износа старых. У взрослых это случается нечасто. У некоторых ящериц во рту смесь зубов акродонтов и плевродонтов, что свидетельствует о редкой гетеродонтии (разная форма и размер зубов) у рептилий. Обычные диеты рептилий с зубами акродонта включают в себя множество беспозвоночных, зелень и мелких млекопитающих!
Барри Берковиц, Питер Шеллис, в: Зубы позвоночных, не являющихся млекопитающими, 2017
(a) Зубной ряд акродонта у крылатого дракона (b) Зубной ряд плевродонта у игуаны с шипастым хвостом.Вы можете видеть, что крепления к кости различаются!
Зубы плевродонта
Зубы плевродонта распространены у многих видов ящериц, включая все подвиды игуан, варанид-варанов и гекконов. Зубы плевродонта прикрепляются поверхностно, как зубы акродонта, но зубы плевродонта закрепляются на внутренней стороне самой челюсти. Это делает их более сильными корнями, но более слабым прикреплением, поскольку они не срослись с костью. Зубы плевродонта могут постоянно расти в том же пространстве, что и исходный зуб.Это пространство постоянно впитывается и восстанавливается по мере роста новых зубов. Помните, что зубы — это живая ткань! Форма зубов плевродонта зависит от вида и может быть очень уникальной, как круглые и уплощенные зубы плевродонта, которые можно увидеть у ящерицы каймана. Их зубы очень специализированы, чтобы сокрушать моллюсков, таких как улитки и моллюски. Согласно одному научному журналу, два метода регенерации зубов плевродонта называются методами «игуанид» и «варанид». Зубы по методу «игуанид» растут на том же месте, что и исходный зуб, тогда как по методу «варанид» зубы растут кзади (позади) исходного зуба.Модели роста этих зубов различаются. Зубы Pleurodont также видны у единственной группы ядовитых ящериц, Heloderma, , которая, как утверждается, способствует увеличению проникновения яда. Согласно одному источнику, «змеиный зубной ряд был описан как Pleurodont, однако в последнее время змеиные зубы обсуждались как« модифицированный Текодонт », потому что каждый зуб срастается с краем неглубокой лунки».
Изображение предоставлено Эндрю Гилпином
Макросъемка акродонта горгульи геккон ( Rhacodactylus auriculatus ), сросшегося с костью.
БАРРИ БЕРКОВИЧ, ПИТЕР ШЕЛЛИС, В ЗУБАХ ПОЗВОНОЧНЫХ, НЕ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, 2017
Модель зубов плевродонта европейской зеленой ящерицы, демонстрирующая нормальный рост и развитие. На этой модели вы можете увидеть «игуанидный» повторный рост ящериц Pleurodont.
Зубы Текодонта
Зубы текодонтов — самые редкие у рептилий, а крокодилы — единственные настоящие рептилии с зубными рядами текодонтов. Зубы крокодилов постоянно заменяются, что жизненно важно для образа жизни их хищников и хищников.Они часто поедают крупную добычу и вступают в жестокие территориальные сражения. В этом им помогают крепкие зубы! Этот цикл непрерывен на протяжении всей жизни крокодилов. С возрастом протезирование зубов замедляется. Зубы кодонта являются самыми прочными, потому что они помещаются в лунки, вырезанные глубже всего в кости челюсти. В то время как зубы большинства рептилий однородны, зубы крокодилов Текодонта — нет, то есть они имеют разные формы и размеры в зависимости от расположения во рту. Это дает им дополнительную ткань и мышцы, которые удерживают зубы на месте, обеспечивая мощь и прочность.По сравнению с другими животными, крокодилы обладают невероятно сильным давлением и силой, согласно научной статье, опубликованной в Journal of Structural Biology. Согласно некоторым исследованиям, змей классифицируют как «модифицированный текодонт», потому что у них есть специально сконструированные зубы, чтобы удерживать добычу, а не жевать ее. Зубы острые и закреплены в карманах челюсти, как правило, под углом спереди, чтобы обезопасить добычу. Согласно ранее упомянутому исследованию, «расположение и количество (змеиных) зубов различаются.У некоторых видов почти нет зубов, а у других много высокоразвитых зубов ». У ядовитых змей очень специализированные зубы с клыками, которые используются для доставки яда. У ядовитых змей есть три типа клыков: протероглифные (фиксированные клыки), опистоглифные (задние клыки) и соленоглифные (складные и передние клыки).
Исследования показали, что «в целом зубы рептилий не были исследованы так тщательно, как зубы других крупных животных». Похоже, лабораторный анализ зубов рептилий конкретных видов отсутствует, и дополнительные исследования деталей анатомии и физиологии рептилий могут помочь в продвижении содержания в неволе и герпетологии!
Источники
https: // www.nature.com/articles/ijos201336
https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/pleurodont
https://cdn.ymaws.com/members.arav.org/resource/resmgr/ Files / Proceedings_2002 / 2002_49.pdf
https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/acrodont
http://www.animalplanet.com/pets/other-pets/oralcavity/
https : //lafeber.com/vet/understanding-reptile-dental-anatomy-clinical-applications/#Snakes
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160608001942
.

Прохладный прием — обзор DLC Челюсти Гаккона — Dragon Age: Inquisition — Игры — Gamer.ru: социальная сеть для геймеров

Драгон эйдж инквизиция челюсти геккона как начать

Обзор DLC Челюсти Гаккона для Dragon Age Inquisition

Обзор Челюсти Гаккона – тайные истории мира

Гаккон Зимодых: как убить?

Dragon Age: Inquisition (+ все DLC) | DarkFess

Челюсти Гаккона

Нисхождение

Чужак

dragon age inquisition способности инквизитора

Способности Воинов

Способности Разбойников

Способности Магов

Обратите внимание!

«Геккон двигает своей верхней челюстью»

Как зубы геккона приспособлены к тому, что он ест?

Строение зуба и челюсти

Замена зубов

Время обеда

Многофункциональные рты

МБД — дефицит кальция — Supreme Gecko

Токайский геккон | Смитсоновский национальный зоопарк

границ | Удаление зубов у леопардового геккона и образование замещающих зубов de novo

Введение

Материалы и методы

Операции по выживанию взрослых гекконов

BrdU Pulse-Chase Experiment

Сканирование мкКТ

Гистология и окрашивание иммунофлуоресценцией

Анализ распространения

TUNEL Assay

Результаты

Восстановление нормальных паттернов замещения зубов через 3 месяца

Ответ клетки на удаление непрорезавшихся зубов второго поколения

BrdU Pulse-Chase зубных эпителиальных клеток для отслеживания потомства клеток, сохраняющих метку

Нулевое время, нормальные модели распространения и максимальное включение BrdU

Через месяц после операции

Через два месяца после операции

Обсуждение

Время замены и формирование зубного ряда взрослого геккона контролируется местными, а не региональными факторами

Для своевременного выпадения зубов могут потребоваться сигналы от непрорезавшихся зубов

Время начала замены зубов не ускоряется после энуклеации зуба

Маркировка BrdU-PCNA позволяет отличить предполагаемые стволовые клетки от их потомства по расположению и фрагментации BrdU

Две интерпретации клеток, меченных BrdU — Дедифференцировка по сравнению со стволовыми клетками / клетками-предшественниками

Двойное мечение с помощью PCNA и BrdU отделяет клетки, усиливающие транзит, от стволовых клеток ткани взрослых

Заявление о доступности данных

Заявление об этике

Авторские взносы

Финансирование

Конфликт интересов

Благодарности

Дополнительные материалы

Список литературы

9. DOI: 10.1002 / bies.201

Есть ли у леопардовых гекконов зубы? Могут ли они кусаться?

Структура зубов леопарда геккона

Замена зубов леопардового геккона

Кусают ли леопардовые гекконы?

Болят ли укусы леопардового геккона?

Ядовиты ли леопардовые гекконы?

Завершение

Зубы рептилий: детали зубов рептилий

Зубы рептилий

Зубья Acrodont

Зубы плевродонта

Зубы Текодонта

Добавить комментарий Отменить ответ